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活性氧调节基因Romo1是细胞内一类重要的供氧因子,它位于线粒体上并通过线粒体电子传递链复合物Ⅲ诱导线粒体ROS的产生。在生理条件下,Romo1维持细胞内ROS的稳态水平来保持机体内氧化还原平衡,同时促进老化细胞和癌细胞的凋亡,并且通过调节P27基因的表达,在细胞增殖中起重要的作用,此外该基因是细胞周期从G1期到S期所必须的。因此,Romo1对细胞的生长和生存起重要的作用。在外源性刺激下,如无血清状态和抗癌药物的刺激时,Romo1基因的表达量增加,进而增加细胞内ROS的水平以应对外源性刺激反应。 活性氧基团(Reactive oxygen species,ROS)是一类具有活性的含氧化合物,它主要是有机体在有氧代谢中通过线粒体电子传递链复合物Ⅰ和Ⅲ产生的。细胞内正常 ROS水平是在0.001μΜ和~0.7μΜ之间,过量的ROS通过抗氧化系统被除去进而来维持氧化还原体内平衡。ROS产量的失衡状态会改变细胞内氧化还原平衡状态,会对细胞和基因结构造成损坏,引起DNA破坏,促进癌症的发生。尽管ROS存在许多负面效应,但是适当的ROS的水平在细胞生长和生存中有重要作用,并且在参与固有免疫应答和适应性免疫应答的抗菌、消炎中具有重要意义。 近年来,国内外对于人类Romo1基因及其编码蛋白的研究取得了初步成果,但是在硬骨鱼中只在斑马鱼中有报道,在鲤鱼中关于Romo1基因的研究至今没有报道,并且虽然Romo1有多种功能,但是对于Romo1的免疫功能研究甚少,目前为止仅在七鳃鳗中研究过该基因的免疫功能,在鲤鱼中还未曾研究。 本研究首先对已报道的多个物种的Romo1基因cDNA序列进行比对,根据保守区设计引物利用反转录PCR和RACE方法,首次克隆得到鲤鱼(Cyprinus carpio.L)Romo1 cDNA全长序列。鲤鱼Romo1基因cDNA序列全长为480bp,包含112bp的5,-非编码区(5,-UTR),240bp的开放阅读框(ORF)及128bp的3,-非编码区(3,-URT)。其中鲤鱼Romo1 mRNA的ORF区编码79个氨基酸。运用Expasy的在线软件Protparam分析蛋白质的理化性质,结果显示Romo1蛋白质的理论分子量为8.3198KDa;理论等电点为9.89;SMART预测蛋白结构显示在氨基酸序列的第23-45位具有一个跨膜结构域,在21-40位氨基酸处具有overlop环状结构;其次用BioEdit7.0软件,将鲤鱼Romo1氨基酸序列与多个物种的Romo1氨基酸序列进行比对,比对结果显示鲤鱼Romo1氨基酸序列与其他物种的Romo1氨基酸序列同源性很高,在进化上高度保守。运用MEGA5.2软件构建各个物种Romo1蛋白系统进化树。如图9所示,鲤鱼Romo1与青鱂Romo1相似度最高,亲缘关系最近。通过进一步的氨基酸序列一致性比较,进一步验证了克隆到的鲤鱼活性氧调节基因 Romo1的进化地位。 利用Real-time PCR方法分析了Romo1 mRNA在正常鲤鱼肝、脾、鳃、头肾、前肠、后肠、皮肤、肌肉、脑、性腺、口腔上皮11种组织中的表达差异,结果分析得Romo1在鲤鱼的体内表达广泛。 本研究利用鱼类常见的致病菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)注射刺激鲤鱼后,用实时荧光定量PCR分析注射刺激后不同的鲤鱼免疫相关组织中的Romo1 mRNA在不同时间段的表达量变化状况,初步研究鲤鱼Romo1的免疫功能。结果显示,Romo1 mRNA水平在鲤鱼头肾、肝脏、前肠、后肠、鳃中显著上调。其中,免疫刺激后鲤鱼 Romo1的表达量在前肠中升高最明显,鳃次之,后肠、头肾、肝脏紧随其后,在脾和皮肤中Romo1的表达水平呈略下降趋势,变化不明显。以上研究表明Romo1在鲤鱼抵抗嗜水气单胞菌的固有免疫反应中发挥重要的作用。