【摘 要】
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目的初步探究基于不同激活条件血小板来源细胞外囊泡（platelet-derived extracellular vesicles,PEVs）的生物学特征及转录组差异,为工程化生产PEVs,针对不同疾病提供针对性临床治疗,增强临床疗效奠定基础。方法设置不同的离心条件、抗凝剂以及保护剂加入时间制备富血小板血浆（Platelet rich Plasma,PRP）,比较血小板回收率、激活率及白细胞残留量的
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目的初步探究基于不同激活条件血小板来源细胞外囊泡（platelet-derived extracellular vesicles,PEVs）的生物学特征及转录组差异,为工程化生产PEVs,针对不同疾病提供针对性临床治疗,增强临床疗效奠定基础。方法设置不同的离心条件、抗凝剂以及保护剂加入时间制备富血小板血浆（Platelet rich Plasma,PRP）,比较血小板回收率、激活率及白细胞残留量的差异,优化血小板采集和制备条件。正交分析得到四种保护剂组合,通过比较在抗凝剂中加入不同保护剂组合后血小板激活率的差异来初步评估能抑制血小板体外激活的最优组合。通过凝血酶、胶原、ADP、钙离子载体和反复冻融激活血小板,差速离心法收集血小板来源的微囊泡（Platelet-derived microvesicles,P-MVs）和外泌体（Platelet-derived exosomes,P-exos）。通过纳米流式分析PEVs的粒径分布和浓度,利用Western-blot和透射电镜对P-exos进行鉴定。转录组芯片检测血小板及反复冻融产生的PEVs的RNA,生物信息学分析差异基因的显著性信号通路及功能,通过qPCR验证芯片结果。结果前5mL与后5mL全血间血小板激活率无统计学差异（P＞0.05）。含保护剂的CTAD抗凝组血小板激活率最低（P＜0.05）,洗涤时加入保护剂血小板激活率升高。120g离心15min与120g离心10min两组得到的血小板,回收率高于其他实验组,激活率低于其他实验组。120g离心15min实验组白细胞残留最少。三磷酸腺苷双磷酸酶、潘生丁、西洛他唑、左旋精氨酸的保护剂组合血小板激活率在72h内低于未加入保护剂的对照组和其他保护剂组合（P＜0.05）。冻融激活下产生的P-MVs和P-exos浓度均高于对照组和其他实验组（P＜0.05）。钙离子载体激活产生的P-exos浓度低于冻融组,高于对照组和其他实验组（P＜0.05）。85-95%的 P-exos 小于 100nm,87-94%的 P-MVs 分布在 100-300nm。血小板与冻融产生的PEVs的转录组有明显差异。对差异基因进行生物统计学分析,与毛囊发育相关的SMAD4、CLOCK、NIPBL基因在P-exos上调,hsacirc0000489可竞争性结合 hsa-miR-3929 和 hsa-miR-548al,上调SMAD4、CLOCK、NIPBL的表达,进而促进毛囊发育。qPCR结果提示相较于血小板和P-MVs,hsacirc0000489以及SMAD4、CLOCK、NIPBL基因在P-exos中表达明显上调（P＜0.05）,符合芯片检测结果。结论利用含三磷酸腺苷双磷酸酶、潘生丁、西洛他唑、左旋精氨酸的抗凝全血,120g离心15min后取血浆制备血小板,能有效提高血小板的稳定性,并且白细胞残留率低,此条件下制备的血小板可作为生物标志物检测和分离纯化PEVs的样本。冻融条件下产生的PEVs浓度最高,粒径偏小。冻融诱导血小板产生的外泌体中上调的基因与调节毛囊发育相关。因此,利用冻融条件产生的P-exos用于临床治疗秃发有望取代PRP,提高临床疗效。
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