【摘 要】
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目的:抑制素被认为是绵羊卵泡发育的负调控蛋白之一,本研究针对新疆地区哈萨克羊繁殖力低、乏情周期长等问题,以本实验室保存的抑制素α亚基基因（INHα）靶向抑制素特异性纳米抗体肽段为基础材料,在构建原核表达载体的基础上,利用Elisa等分子生物技术验证其与抑制蛋白的亲和性。进一步通过动物免疫实验初步评价该肽段对绵羊发情季节内源性抑制素的免疫效果,并系统分析由此引起的促卵泡素等相关激素的变化情况。方法:
【基金项目】
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新疆农垦科学院省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室开放课题,绵羊 Inhα基因阻断肽的筛选和鉴定,项目编号:MYSKLKF201903； 新疆生产建设兵团国际科技合作项目,中-哈边境地区蜱种“DNA 条形码”数据库建设与蜱传病原谱分析,项目编号:2020BC008；
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目的:抑制素被认为是绵羊卵泡发育的负调控蛋白之一,本研究针对新疆地区哈萨克羊繁殖力低、乏情周期长等问题,以本实验室保存的抑制素α亚基基因（INHα）靶向抑制素特异性纳米抗体肽段为基础材料,在构建原核表达载体的基础上,利用Elisa等分子生物技术验证其与抑制蛋白的亲和性。进一步通过动物免疫实验初步评价该肽段对绵羊发情季节内源性抑制素的免疫效果,并系统分析由此引起的促卵泡素等相关激素的变化情况。方法:本实验（1）对本课题组前期从噬菌体文库中筛选出的一株对抑制素αELISA显示阳性的噬菌体载体菌株Nb4进行基因克隆,并确定其片段大小以及模板片段的突变情况;进一步设计带酶切位点的特异性引物,利用常规分子生物技术构建Nb4基因靶向原核表达载体pET 32a-Nb4并对其进行双酶切电泳鉴定及测序分析。（2）对构建好的Nb4基因原核表达载体及INHα基因原核表达载体在大肠杆菌表达系统中进行表达形式及最佳诱导时间的鉴定并进行蛋白纯化,进一步利用Western blot、Elisa等技术检测蛋白大小以及Nb4抗体与抑制素蛋白的亲和性;（3）随机挑选52只发情时间相近并处于间情期的成年阿勒泰羊随机分为4组,依次作为抑制素α重组蛋白+佐剂免疫组（A组）,抑制素α重组蛋白免疫组（B组）,抗抑制素α纳米抗体重组蛋白免疫组（C组）,生理盐水组（D组）,十天后再进行一次加强免疫。分别于免疫前和免疫后三天对其进行颈静脉采血,使用绵羊生殖激素ELISA测定试剂盒测定分析绵羊血清中六种相关生殖激素的含量,并分析六种激素在绵羊血液中的变化情况。结果:（1）pET 32a-Nb4原核表达菌株测序结果正确且无突变情况,成功构建了Nb4基因原核表达载体;（2）Nb4基因原核菌株在37℃、170r/min、IPTG浓度为1 mg/m L条件下的最佳诱导时间为3 h,以包涵体的形式表达,且Nb4基因原核表达蛋白和抑制素α基因原核表达蛋白纯化后SDS-PAGE电泳显示成功诱导表达Nb4和抑制素α,且纯化后蛋白无杂带;Elisa结果显示原核表达的抗抑制素α纳米抗体与抑制素α蛋白的结合活性在纳克范围内;（3）SPSS25.0统计学分析显示免疫后A组INHA含量和C组INHA、PROG含量与D组相比存在显著性差异（P＜0.05）,均表现为下降趋势,且C组INHA含量下降比A组更明显,其它数据均表现为不存在显著差异（P＞0.05）。结论:抑制素α蛋白免疫和抗抑制素α纳米抗体蛋白免疫均对绵羊血液中抑制素的合成有抑制作用,且抗抑制素α纳米抗体免疫对抑制素的抑制效果强于抑制素α蛋白主动免疫效果。
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