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2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是两种常见的年龄相关疾病。伴随着全球人口老龄化的加剧，它们的发病率和患病率都在不断攀升。目前，全球T2D患者人数高达4.63亿，同时痴呆人数超过5000万(AD患者占50–60%)。大量流行病学证据表明，T2D和AD之间存在双向关联。T2D患者的AD发病风险是非T2D人群的1.53倍。同时，AD患者也较认知正常人群呈现出更为严重的葡萄糖和胰岛素代谢受损。尽管已经发现T2D和AD之间存在许多共同的病理特征，包括胰岛素抵抗、蛋白错误折叠、炎症、氧化应激以及血管功能障碍，但是T2D和AD之间关联的分子机制仍不清楚。因此，积极探索T2D和AD的关联机制，可能为两者的共同防治提供新思路。
β-淀粉样肽(β-amyloid，Aβ)是AD的特征性标志物之一，其主要存在形式是Aβ40和Aβ42。在AD患者脑中，Aβ大量生成并且聚集形成老年斑，因而脑脊液Aβ水平检测和脑组织Aβ沉积造影被作为重要的AD诊断方法。值得注意的是，超过40%的脑内的Aβ会通过多种途径转运至外周。同时，考虑到腰椎穿刺的创伤性以及Aβ沉积造影的昂贵花费，血浆Aβ作为可能的AD标志物而备受关注。一项基于队列研究的meta分析结果表明，AD患者的血浆Aβ40和Aβ42水平较认知正常人群显著升高。此外，动物实验表明血浆Aβ升高能够引起外周胰岛素抵抗。进一步研究发现，针对血浆Aβ的主动或被动免疫能够改善实验动物的胰岛素抵抗状态。截至目前，几项横断面研究比较了T2D和非T2D人群血浆Aβ40和Aβ42水平的差异，但未得出一致结论，而且尚未见相关的前瞻性研究。
外周胰岛素抵抗是T2D的主要发病机制之一。早期研究表明，Aβ能够通过多种机制诱导神经细胞的胰岛素抵抗的发生。同时，体外研究发现Aβ25-35能直接减弱胰岛素对肝细胞糖异生的抑制作用，而Aβ40和Aβ42是否具有相同作用尚不清楚。除了抑制糖异生，促进细胞对葡萄糖的摄取利用也是胰岛素调控血糖的重要途径，其中骨骼肌细胞是主要靶细胞之一。然而，尚无研究探讨Aβ40和Aβ42对骨骼肌细胞的胰岛素敏感性的影响。
因此，本研究拟开展大样本量的病例对照研究，探讨血浆Aβ40和Aβ42水平与糖调节受损(impaired glucose regulation，IGR)和T2D患病风险的关联性；采用前瞻性巢式病例对照设计，进一步探究血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D发病风险的关联性；通过体外研究，探讨Aβ40和Aβ42对人肝癌细胞株HepG2和小鼠成肌细胞系C2C12的胰岛素敏感性的影响，为流行病学研究提供机制依据。本研究的主要内容分为以下三个部分：
第一部分血浆β-淀粉样肽40和42水平与糖调节受损和2型糖尿病患病风险的关联性
目的：探究血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D患病风险的关联性。
方法：采用病例对照设计，以2012年至2015年期间在武汉市同济医院进行糖尿病筛查的人群为研究对象，纳入571例新诊断的IGR患者、1063例新诊断的T2D患者和1063例按照年龄(±3岁)、性别以及载脂蛋白E?4等位基因(apolipoprotein E ?4，APOE ?4)携带状况进行匹配的对照。血浆Aβ40和Aβ42水平采用电化学发光免疫分析法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)同时测定。采用多因素条件logistic回归模型分析血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D患病风险的关联性。校正因素包括年龄、性别、体质指数(body mass index， BMI)、APOE?4携带状况、吸烟状况、饮酒状况、运动状况、家族糖尿病史和高血压患病史。
结果：IGR组、T2D组和对照组的血浆Aβ40水平分别为134.09(118.70–153.61)ng/L、134.45(117.99–154.58)ng/L和126.99(114.36–144.85)ng/L；血浆Aβ42水平分别为13.25(10.78–16.59)ng/L、13.25(11.04–16.14)ng/L和12.21(10.00–14.94)ng/L。与对照组相比，IGR组和T2D组的血浆Aβ40和Aβ42水平都显著较高(P<0.001)。血浆Aβ40水平的最高四分位组(Q4)与最低四分位组(Q1)相比，IGR和T2D的多因素校正风险比值比(odds ratio，OR)和95%置信区间(confidence interval，CI)分别为2.06(1.38–3.06)和1.96(1.45–2.65)。血浆Aβ40水平每增加30ng/L，IGR和T2D患病风险分别升高19%(4%–37%)和28%(14%–43%)。血浆Aβ42水平的Q4组与Q1组相比，IGR和T2D的多因素校正OR(95%CI)分别为1.80(1.25–2.60)和2.01(1.50–2.69)。血浆Aβ42水平每增加5ng/L，IGR和T2D患病风险分别升高39%(19%–62%)和37%(21%–55%)。在几乎全部亚组中，血浆Aβ40和Aβ42与IGR&T2D仍存在显著正关联。血浆Aβ40与IGR&T2D的关联在不运动的人群(P-交互=0.008)中更强。血浆Aβ42与IGR&T2D的关联在小于等于50岁的人群(P-交互<0.001)、男性(P-交互=0.016)或不运动的人群(P-交互=0.004)中更强。与血浆Aβ40和Aβ42水平都处于最低三分位的人群相比，血浆Aβ40和Aβ42水平都处于最高三分位的人群的IGR和T2D患病风险分别为3.38倍和2.96倍。
结论：本研究表明，血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D患病风险存在显著正关联。然而，血浆Aβ40和Aβ42与T2D的关联性仍需在前瞻性研究中进一步验证。
第二部分血浆β-淀粉样肽40和42水平与糖调节受损和2型糖尿病发病风险的前瞻性关联
目的：探究血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D发病风险的前瞻性关联。
方法：基于同济-鄂州队列开展巢式病例对照研究，纳入100例新发IGR患者、121例新发T2D患者和442例依据年龄(±3岁)、性别进行匹配的对照。基线血浆Aβ40和Aβ42水平采用ECLIA同时测定。采用多因素条件logistic回归模型分析血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D发病风险的关联性。校正因素包括年龄、性别、BMI、吸烟状况、饮酒状况、运动状况、家族糖尿病史和高血压患病史。
结果：IGR组、T2D组和对照组的血浆Aβ40水平分别为143.98(123.73–175.24)ng/L、142.91(122.18–177.23)ng/L和128.82(112.33–152.32)ng/L；血浆Aβ42水平分别为13.96(11.03–17.50)ng/L、13.92(11.29–17.86)ng/L和12.21(10.31–15.10)ng/L。与对照组相比，IGR组和T2D组的血浆Aβ40和Aβ42水平都显著较高(P<0.001)。校正多个混杂因素后，与血浆Aβ40水平的Q1组相比，血浆Aβ40水平Q4组的IGR和T2D的OR(95%CI)分别为3.33(1.56–7.13)和3.79(1.81–7.94)。血浆Aβ40水平每增加30ng/L，IGR和T2D的发病风险分别升高54%(23%–92%)和47%(15%–88%)。与血浆Aβ42水平的Q1组相比，血浆Aβ42水平Q4组的IGR和T2D的OR(95%CI)分别为2.85(1.27–6.39)和2.88(1.44–5.75)。血浆Aβ42水平每增加5ng/L，IGR和T2D的发病风险分别升高64%(20%–124%)和53%(19%–96%)。除了按年龄和吸烟状况分层的亚组外，所有亚组中血浆Aβ40和Aβ42与IGR&T2D仍存在显著正关联。
结论：本研究表明，血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D发病风险存在显著正关联。然而，血浆Aβ40和Aβ42增加T2D发病风险的机制仍需进一步研究探讨。
第三部分β-淀粉样肽40和42对HepG2细胞和C2C12细胞的胰岛素敏感性的影响
目的：探究Aβ40和Aβ42对HepG2细胞和C2C12细胞胰岛素敏感性的影响。
方法：HepG2细胞和C2C12细胞复苏后接种于培养皿中，每日观察细胞状态及密度，当细胞铺满80%时进行传代。按实验所需将细胞接种于96孔或12孔板中，HepG2细胞完全贴壁即可用于实验，而C2C12细胞分化形成肌管才可用于实验。采用CCK-8试剂盒检测细胞活性，确定Aβ处理时间为48h，确定实验分组如下：(1)空白对照组：等量培养液；(2)胰岛素组(insulin)：100nMinsulin；(3)Aβ40低剂量组(Aβ40-L)：2μMAβ40+100nMinsulin；(4)Aβ40中剂量组(Aβ40-M)：10μMAβ40+100nMinsulin；(5)Aβ40高剂量组(Aβ40-H)：20μMAβ40+100nMinsulin；(6)Aβ40-1组(Aβ40反氨基酸序列对照物)：20μMAβ40-1+100nMinsulin；(7)Aβ42低剂量组(Aβ42-L)：2μMAβ42+100nMinsulin；(8)Aβ42中剂量组(Aβ42-M)：10μMAβ42+100nMinsulin；(9)Aβ42高剂量组(Aβ42-H)：20μMAβ42+100nMinsulin；(10)Aβ42-1组(Aβ42反氨基酸序列对照物)：20μMAβ42-1+100nMinsulin。将12孔板按以上分组进行Aβ处理，采用葡萄糖合成实验评估Aβ对HepG2细胞胰岛素敏感性的影响；采用葡萄糖摄取实验评估Aβ对C2C12细胞胰岛素敏感性的影响。
结果：(1)与空白对照组相比，胰岛素组HepG2细胞的葡萄糖合成降低了27%(P<0.05)。Aβ40和Aβ42能够剂量依赖性地减弱胰岛素的作用，Aβ40高剂量组的葡萄糖合成与空白对照组无显著差异。与胰岛素组(73%±6%)相比，Aβ40中剂量组(84%±1%)和Aβ40高剂量组(95%±11%)的葡萄糖合成显著升高(P<0.05)。同样，Aβ42中剂量组(84%±1%)和Aβ42高剂量组(88%±4%)的葡萄糖合成也显著高于胰岛素组(P<0.05)。与之相反，Aβ40-1和Aβ42-1组的葡萄糖合成与胰岛素组相比无显著差异。
(2)与空白对照组相比，胰岛素组C2C12细胞的葡萄糖摄取增加了153%(P<0.05)。Aβ40和Aβ42能够剂量依赖性地减弱胰岛素的作用，但与空白对照组相比，Aβ40高剂量组和Aβ42高剂量组的葡萄糖摄取仍分别增加了100%和60%(P<0.05)。与胰岛素组(253%±25%)相比，Aβ40高剂量组(202%±15%)的葡萄糖摄取显著降低(P<0.05)，同时Aβ42中剂量组(199%±9%)和Aβ42高剂量组(160%±6%)的葡萄糖摄取也显著降低(P<0.05)。然而，Aβ40-1和Aβ42-1组的葡萄糖摄取与胰岛素组相比无显著差异。
结论：Aβ40和Aβ42能够降低HepG2细胞和C2C12细胞的胰岛素敏感性，且随着浓度增加，其作用强度增强。Aβ40-1和Aβ42-1对HepG2细胞和C2C12细胞的胰岛素敏感性无显著作用，提示氨基酸序列可能是Aβ40和Aβ42诱导外周胰岛素抵抗的重要基础。然而，Aβ40和Aβ42诱导肝细胞和骨骼肌细胞的胰岛素抵抗的具体分子机制需要进一步研究探讨。
β-淀粉样肽(β-amyloid，Aβ)是AD的特征性标志物之一，其主要存在形式是Aβ40和Aβ42。在AD患者脑中，Aβ大量生成并且聚集形成老年斑，因而脑脊液Aβ水平检测和脑组织Aβ沉积造影被作为重要的AD诊断方法。值得注意的是，超过40%的脑内的Aβ会通过多种途径转运至外周。同时，考虑到腰椎穿刺的创伤性以及Aβ沉积造影的昂贵花费，血浆Aβ作为可能的AD标志物而备受关注。一项基于队列研究的meta分析结果表明，AD患者的血浆Aβ40和Aβ42水平较认知正常人群显著升高。此外，动物实验表明血浆Aβ升高能够引起外周胰岛素抵抗。进一步研究发现，针对血浆Aβ的主动或被动免疫能够改善实验动物的胰岛素抵抗状态。截至目前，几项横断面研究比较了T2D和非T2D人群血浆Aβ40和Aβ42水平的差异，但未得出一致结论，而且尚未见相关的前瞻性研究。
外周胰岛素抵抗是T2D的主要发病机制之一。早期研究表明，Aβ能够通过多种机制诱导神经细胞的胰岛素抵抗的发生。同时，体外研究发现Aβ25-35能直接减弱胰岛素对肝细胞糖异生的抑制作用，而Aβ40和Aβ42是否具有相同作用尚不清楚。除了抑制糖异生，促进细胞对葡萄糖的摄取利用也是胰岛素调控血糖的重要途径，其中骨骼肌细胞是主要靶细胞之一。然而，尚无研究探讨Aβ40和Aβ42对骨骼肌细胞的胰岛素敏感性的影响。
因此，本研究拟开展大样本量的病例对照研究，探讨血浆Aβ40和Aβ42水平与糖调节受损(impaired glucose regulation，IGR)和T2D患病风险的关联性；采用前瞻性巢式病例对照设计，进一步探究血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D发病风险的关联性；通过体外研究，探讨Aβ40和Aβ42对人肝癌细胞株HepG2和小鼠成肌细胞系C2C12的胰岛素敏感性的影响，为流行病学研究提供机制依据。本研究的主要内容分为以下三个部分：
第一部分血浆β-淀粉样肽40和42水平与糖调节受损和2型糖尿病患病风险的关联性
目的：探究血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D患病风险的关联性。
方法：采用病例对照设计，以2012年至2015年期间在武汉市同济医院进行糖尿病筛查的人群为研究对象，纳入571例新诊断的IGR患者、1063例新诊断的T2D患者和1063例按照年龄(±3岁)、性别以及载脂蛋白E?4等位基因(apolipoprotein E ?4，APOE ?4)携带状况进行匹配的对照。血浆Aβ40和Aβ42水平采用电化学发光免疫分析法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)同时测定。采用多因素条件logistic回归模型分析血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D患病风险的关联性。校正因素包括年龄、性别、体质指数(body mass index， BMI)、APOE?4携带状况、吸烟状况、饮酒状况、运动状况、家族糖尿病史和高血压患病史。
结果：IGR组、T2D组和对照组的血浆Aβ40水平分别为134.09(118.70–153.61)ng/L、134.45(117.99–154.58)ng/L和126.99(114.36–144.85)ng/L；血浆Aβ42水平分别为13.25(10.78–16.59)ng/L、13.25(11.04–16.14)ng/L和12.21(10.00–14.94)ng/L。与对照组相比，IGR组和T2D组的血浆Aβ40和Aβ42水平都显著较高(P<0.001)。血浆Aβ40水平的最高四分位组(Q4)与最低四分位组(Q1)相比，IGR和T2D的多因素校正风险比值比(odds ratio，OR)和95%置信区间(confidence interval，CI)分别为2.06(1.38–3.06)和1.96(1.45–2.65)。血浆Aβ40水平每增加30ng/L，IGR和T2D患病风险分别升高19%(4%–37%)和28%(14%–43%)。血浆Aβ42水平的Q4组与Q1组相比，IGR和T2D的多因素校正OR(95%CI)分别为1.80(1.25–2.60)和2.01(1.50–2.69)。血浆Aβ42水平每增加5ng/L，IGR和T2D患病风险分别升高39%(19%–62%)和37%(21%–55%)。在几乎全部亚组中，血浆Aβ40和Aβ42与IGR&T2D仍存在显著正关联。血浆Aβ40与IGR&T2D的关联在不运动的人群(P-交互=0.008)中更强。血浆Aβ42与IGR&T2D的关联在小于等于50岁的人群(P-交互<0.001)、男性(P-交互=0.016)或不运动的人群(P-交互=0.004)中更强。与血浆Aβ40和Aβ42水平都处于最低三分位的人群相比，血浆Aβ40和Aβ42水平都处于最高三分位的人群的IGR和T2D患病风险分别为3.38倍和2.96倍。
结论：本研究表明，血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D患病风险存在显著正关联。然而，血浆Aβ40和Aβ42与T2D的关联性仍需在前瞻性研究中进一步验证。
第二部分血浆β-淀粉样肽40和42水平与糖调节受损和2型糖尿病发病风险的前瞻性关联
目的：探究血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D发病风险的前瞻性关联。
方法：基于同济-鄂州队列开展巢式病例对照研究，纳入100例新发IGR患者、121例新发T2D患者和442例依据年龄(±3岁)、性别进行匹配的对照。基线血浆Aβ40和Aβ42水平采用ECLIA同时测定。采用多因素条件logistic回归模型分析血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D发病风险的关联性。校正因素包括年龄、性别、BMI、吸烟状况、饮酒状况、运动状况、家族糖尿病史和高血压患病史。
结果：IGR组、T2D组和对照组的血浆Aβ40水平分别为143.98(123.73–175.24)ng/L、142.91(122.18–177.23)ng/L和128.82(112.33–152.32)ng/L；血浆Aβ42水平分别为13.96(11.03–17.50)ng/L、13.92(11.29–17.86)ng/L和12.21(10.31–15.10)ng/L。与对照组相比，IGR组和T2D组的血浆Aβ40和Aβ42水平都显著较高(P<0.001)。校正多个混杂因素后，与血浆Aβ40水平的Q1组相比，血浆Aβ40水平Q4组的IGR和T2D的OR(95%CI)分别为3.33(1.56–7.13)和3.79(1.81–7.94)。血浆Aβ40水平每增加30ng/L，IGR和T2D的发病风险分别升高54%(23%–92%)和47%(15%–88%)。与血浆Aβ42水平的Q1组相比，血浆Aβ42水平Q4组的IGR和T2D的OR(95%CI)分别为2.85(1.27–6.39)和2.88(1.44–5.75)。血浆Aβ42水平每增加5ng/L，IGR和T2D的发病风险分别升高64%(20%–124%)和53%(19%–96%)。除了按年龄和吸烟状况分层的亚组外，所有亚组中血浆Aβ40和Aβ42与IGR&T2D仍存在显著正关联。
结论：本研究表明，血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D发病风险存在显著正关联。然而，血浆Aβ40和Aβ42增加T2D发病风险的机制仍需进一步研究探讨。
第三部分β-淀粉样肽40和42对HepG2细胞和C2C12细胞的胰岛素敏感性的影响
目的：探究Aβ40和Aβ42对HepG2细胞和C2C12细胞胰岛素敏感性的影响。
方法：HepG2细胞和C2C12细胞复苏后接种于培养皿中，每日观察细胞状态及密度，当细胞铺满80%时进行传代。按实验所需将细胞接种于96孔或12孔板中，HepG2细胞完全贴壁即可用于实验，而C2C12细胞分化形成肌管才可用于实验。采用CCK-8试剂盒检测细胞活性，确定Aβ处理时间为48h，确定实验分组如下：(1)空白对照组：等量培养液；(2)胰岛素组(insulin)：100nMinsulin；(3)Aβ40低剂量组(Aβ40-L)：2μMAβ40+100nMinsulin；(4)Aβ40中剂量组(Aβ40-M)：10μMAβ40+100nMinsulin；(5)Aβ40高剂量组(Aβ40-H)：20μMAβ40+100nMinsulin；(6)Aβ40-1组(Aβ40反氨基酸序列对照物)：20μMAβ40-1+100nMinsulin；(7)Aβ42低剂量组(Aβ42-L)：2μMAβ42+100nMinsulin；(8)Aβ42中剂量组(Aβ42-M)：10μMAβ42+100nMinsulin；(9)Aβ42高剂量组(Aβ42-H)：20μMAβ42+100nMinsulin；(10)Aβ42-1组(Aβ42反氨基酸序列对照物)：20μMAβ42-1+100nMinsulin。将12孔板按以上分组进行Aβ处理，采用葡萄糖合成实验评估Aβ对HepG2细胞胰岛素敏感性的影响；采用葡萄糖摄取实验评估Aβ对C2C12细胞胰岛素敏感性的影响。
结果：(1)与空白对照组相比，胰岛素组HepG2细胞的葡萄糖合成降低了27%(P<0.05)。Aβ40和Aβ42能够剂量依赖性地减弱胰岛素的作用，Aβ40高剂量组的葡萄糖合成与空白对照组无显著差异。与胰岛素组(73%±6%)相比，Aβ40中剂量组(84%±1%)和Aβ40高剂量组(95%±11%)的葡萄糖合成显著升高(P<0.05)。同样，Aβ42中剂量组(84%±1%)和Aβ42高剂量组(88%±4%)的葡萄糖合成也显著高于胰岛素组(P<0.05)。与之相反，Aβ40-1和Aβ42-1组的葡萄糖合成与胰岛素组相比无显著差异。
(2)与空白对照组相比，胰岛素组C2C12细胞的葡萄糖摄取增加了153%(P<0.05)。Aβ40和Aβ42能够剂量依赖性地减弱胰岛素的作用，但与空白对照组相比，Aβ40高剂量组和Aβ42高剂量组的葡萄糖摄取仍分别增加了100%和60%(P<0.05)。与胰岛素组(253%±25%)相比，Aβ40高剂量组(202%±15%)的葡萄糖摄取显著降低(P<0.05)，同时Aβ42中剂量组(199%±9%)和Aβ42高剂量组(160%±6%)的葡萄糖摄取也显著降低(P<0.05)。然而，Aβ40-1和Aβ42-1组的葡萄糖摄取与胰岛素组相比无显著差异。
结论：Aβ40和Aβ42能够降低HepG2细胞和C2C12细胞的胰岛素敏感性，且随着浓度增加，其作用强度增强。Aβ40-1和Aβ42-1对HepG2细胞和C2C12细胞的胰岛素敏感性无显著作用，提示氨基酸序列可能是Aβ40和Aβ42诱导外周胰岛素抵抗的重要基础。然而，Aβ40和Aβ42诱导肝细胞和骨骼肌细胞的胰岛素抵抗的具体分子机制需要进一步研究探讨。