【摘 要】
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2020年SARS-CoV-2病毒的全球大流行给全世界带来了前所未有的公共卫生健康安全问题,并且对全世界的经济造成了巨大的冲击。全面了解该病毒的感染特征,尤其是针对病原体本身的生物学特征及其与宿主细胞免疫系统相互作用的研究对于揭示SARS-CoV-2的致病机理具有重要意义。现在很多研究和临床报告的研究表明SARS-CoV-2的感染会对机体的天然免疫及之后的适应性免疫动员产生抑制作用,在这个过程中病
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2020年SARS-CoV-2病毒的全球大流行给全世界带来了前所未有的公共卫生健康安全问题,并且对全世界的经济造成了巨大的冲击。全面了解该病毒的感染特征,尤其是针对病原体本身的生物学特征及其与宿主细胞免疫系统相互作用的研究对于揭示SARS-CoV-2的致病机理具有重要意义。现在很多研究和临床报告的研究表明SARS-CoV-2的感染会对机体的天然免疫及之后的适应性免疫动员产生抑制作用,在这个过程中病毒与宿主细胞的相互作用所产生了一系列分子事件,包括病毒基因组复制、结构蛋白和非结构蛋白对细胞内天然免疫分子的调控等,都将对机体抗病毒免疫的启动产生影响。已有的关于SARS-CoV的研究提示病毒结构蛋白中膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）是对固有免疫能产生的抑制作用,现在已经有多篇文献报道SARS-CoV-2的M蛋白也存在天然免疫抑制的作用,但关于N蛋白的研究还鲜有报道,本实验拟对SARS-CoV-2的N蛋白在感染过程中对天然免疫的影响进行进一步的探究。本文首先通过SARS-CoV-2感染16HBE细胞的体外实验,对SARS-CoV-2感染和增殖特性进行了探究,结果中我们发现SARS-CoV-2在16HBE细胞上的早期增殖能力较弱,我们通过Real-time PCR检测ISG15、CXCL-10、NF-κB、IFN-α和IFN-β表达量的改变和用Western Blot检测IRF3、TBK1和NF-κB磷酸化的改变,发现随着病毒感染进程的推进RLRs信号通路会出现被抑制的现象。之后我们在HEK293T细胞中过表达了不同SARS-CoV-2病毒蛋白组分,检测他们对IFN-β产生的影响,结果表明N蛋白作为SARS-CoV-2结构蛋白的一员能够抑制IFN-β的产生。利用免疫共沉淀实验我们发现SARS-CoV-2的N蛋白能够与TRIM25相互作用抑制RLRs信号通路的激活。同时,我们发现G3BP2蛋白能同时与TRIM25和N蛋白发生相互作用。进一步的实验我们发现N蛋白的出现能够起到促进G3BP2与TRIM25相互作用的功能。为了进一步探究G3BP2在RLRs信号通路中起到的作用,我们在A549细胞中过表达G3BP2,通过相关基因的核酸水平改变和相关蛋白的磷酸化水平改变发现RLRs信号通路的激活受到了抑制,并且过表达的G3BP2能够与胞内本身的TRIM25发生相互作用。我们猜测G3BP2或通过与TRIM25相互作用抑制了 RLRs信号通路的激活,于是我们利用siRNA敲低细胞中的G3BP2,结果显示当细胞中的G3BP2被敲低后,能够促进RLRs信号通路的激活,TBKI、IRF3和NF-κB的磷酸化水平明显高于对照细胞,但RLRs过度激活后IFN-β的产生似乎受到了抑制,因此我们推测G3BP2的或许对RLRs信号通路的激活和调节还存在其他重要的作用。在进一步的恒河猴的体内感染实验中,我们发现感染SARS-CoV-2中后期的恒河猴体内的NK细胞数量会受到抑制,这表明了 SARS-CoV-2的确能够抑制机体的固有免疫的激活。对感染后的恒河猴鼻咽部和肺部组织切片进行免疫荧光实验,我们也发现了病毒N蛋白与促进G3BP2与TRIM25募集和结合相关。上述研究结果提示,进一步阐明N蛋白抑制RLRs途径活化的机制,对于了解SARS-CoV-2肺部感染致病机制和病毒核衣壳蛋白在免疫逃逸中的作用具有一定的指导作用。
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