目的 筛选冬凌草甲素作用于胰腺癌细胞后差异表达的lncRNA,研究冬凌草甲素对胰腺癌细胞lncRNA基因表达的调控作用,分析冬凌草甲素协同siRNA AFAP1-AS1对胰腺癌细胞凋亡、周期与EMT的影响,探讨冬凌草甲素协同siRNA AFAP1-AS1抗肿瘤的分子机制,为冬凌草甲素抗肿瘤提供可能的途经和理论依据。方法1.无菌培养胰腺癌BxPC-3和PANC-1细胞,CCK-8实验筛选冬凌草甲素作用BxPC-3和PANC-1细胞24h后抑制细胞增殖的最佳作用浓度。2.通过荧光定量PCR技术初步检测7条在胰腺癌中过表达的lncRNA在冬凌草甲素处理前后的胰腺癌BxPC-3细胞和PANC-1细胞中表达变化,发现lncRNA AFAP1-AS 1在冬凌草甲素处理后的BxPC-3和PANC-1中表达明显下调,选取LncRNA AFAP1-AS1为研究对象。3.利用公司合成lncRNA AFAP1-AS1的干扰RNA（siAFAP1-AS1）及其阴性对照物（siNC）转染胰腺癌BxPC-3和PANC-1细胞,分别设siNC组、siAFAP1-AS1组、siNCori组,siAFAP1-AS1ori组,流式细胞实验检测胰腺癌细胞凋亡和周期的变化,Hoechst 33258染色检测胰腺癌细胞凋亡,Transwell细胞迁移实验和RTCA实验检测冬凌草甲素和lncRNA AFAP1-AS1对胰腺癌细胞迁移的影响,Western Blot实验检测胰腺癌细胞凋亡、周期和EMT相关蛋白的表达情况。4.用靶向敲降AFAP1-AS1的慢病毒载体转染胰腺癌BxPC-3和PANC-1细胞,构建稳定敲降AFAP1-AS1的细胞株和对照细胞株,动物移植瘤实验检测冬凌草甲素协同shRNA AFAP1-AS1在体内对胰腺癌的影响。结果1.CCK-8实验结果显示冬凌草甲素能抑制BxPC-3和PANC-1细胞增殖,并且呈剂量依赖性,且IC50分别是96.109μM和97.324μM。2.Q-PCR实验结果显示:7条在胰腺癌中过表达的lncRNA中,lncRNAAFAP1-AS1在冬凌草甲素处理后的胰腺癌BxPC-3和PANC-1细胞内显著下调。3.siAFAP1-AS1及其阴性对照物siNC瞬时转染成功,荧光图结果显示转染率＞85%;Q-PCR结果显示,siAFAP1-AS1组较siNC组lncRNA AFAP1-AS1显著下调,差异具有显著统计学意义。4.Hoechst 33258荧光染色结果显示:siNC和siAFAP1-AS1组均呈均匀微弱的荧光。而siNCori和siAFAP1-AS1ori组细胞呈浓缩致密的强蓝色荧光,且siAFAP1-AS1ori组强蓝色荧光细胞多于siNCori组。5.流式细胞实验检测细胞凋亡和周期,结果显示敲降AFAP1-AS1后对胰腺癌BxPC-3和PANC-1细胞周期和凋亡影响不大,siAFAP1-AS1ori组相比siNCori组,细胞凋亡率显著增加,阻滞在G2/M期的细胞显著增加。6.Western Blot实验结果显示,敲降AFAP1-AS1后对胰腺癌BxPC-3和PANC-1细胞蛋白 Bcl-2、CDK1、Bax 表达影响不大,siAFAP1-AS1ori 组相比 siNCori 组,Bcl-2、CDK1蛋白表达显著下调,Bax蛋白表达显著上调。7.细胞迁移（Transwell）和RTCA实验结果显示:胰腺癌细胞敲降AFAP1-AS1后能明显抑制BxPC-3和PANC-1细胞的迁移能力,siAFAP1-ASlori组相比siNCori组,对细胞迁移的抑制作用更加明显。8.Western Blot实验结果显示:敲降AFAP1-AS1后胰腺癌BxPC-3和PANC-1细胞内 Fibronectin、ZEB1、N-cadherin、MMP9、MMP2、Slug、Snail 等 EMT 相关蛋白表达下调,E-cadherin 蛋白表达上调,siAFAP1-AS1ori 组相比 siNCori 组,Fibronectin、ZEB1、N-cadherin、MMP9、MMP2、Slug、Snail 蛋白的表达显著下调,E-cadherin 蛋白的表达显著上调。9.动物实验结果显示:敲降AFAP1-AS1后进行冬凌草甲素处理可以显著抑制肿瘤的生长。结论1.冬凌草甲素抑制BxPC-3、PANC-1细胞的增殖,下调lncRNA AFAP1-AS1的表达。2.敲降AFAP1-AS1对胰腺癌细胞周期和凋亡影响不大,敲降AFAP1-AS1可以增强冬凌草甲素诱导胰腺癌BxPC-3和PANC-1细胞凋亡及细胞周期阻滞的能力。3.敲降AFAP1-AS1和冬凌草甲素作用均能抑制胰腺癌BxPC-3、PANC-1细胞EMT,两者联合能增强抑制作用。4.在裸鼠体内,敲降AFAP1-AS1和冬凌草甲素均能抑制胰腺肿瘤的生长,两者联合能增强抑制作用。