肝细胞癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,中国人群中的慢性乙型肝炎病毒感染率高,使得我国占到了全球每年新发病例的55%,成为全世界肝癌最高发的地区之一。肝移植作为一种潜在的肝癌根治性手段,不仅能完整切除肿瘤,而且纠正严重的肝硬化,但是肝移植术后肿瘤的复发转移严重地制约了患者的长期生存,因此,有效防治肝癌肝移植术后的肿瘤复发转移已经成为急需解决的瓶颈问题。第一部分肝癌肝移植组织中长链非编码RNA的鉴定目的：通过对肝癌肝移植样本的转录组学研究,特别是在肿瘤特异性长链非编码RNA方面的研究,进而对肝细胞癌的异质性及生物学机制有一个更加全面的认识。方法：入选10例接受肝移植手术的肝癌患者样本,病人的病理资料及临床数据完整。提取RNA后,采用solexa测序技术,对癌及癌旁组织进行转录组测序,应用生物信息学手段进行数据分析。结果：我们分析了10例肝癌及配对癌旁组织的长链非编码RNA的表达情况,根据Fold Change≥2-fold和FDR≤0.05,且在5例以上样本中有表达差异的标准,共筛选到17个具有表达差异的IncRNA(已注释)。随后,进行染色体上位置的标注,发现它们大部分位于肝细胞癌染色体的杂合性缺失或扩增区域。结论：在肝癌肝移植组织中筛选到的17个差异表达的长链非编码RNA,为进一步深入研究其表达模式及功能奠定基础,为肝癌肝移植术后预防复发转移提供新思路和新方法。第二部分基于转录组测序筛选的新型长链非编码RNA HOTTIP在移植术后肝癌复发中的作用及分子机制研究目的：肝癌肝移植术后肿瘤复发是一个在多个水平上发生多基因改变的复杂过程。研究报道长链非编码RNA在肿瘤的发生发展和复发转移过程中发挥了重要作用。我们在前期完成了10对肝癌组织及配对癌旁组织样本的转录组测序后,筛选出一个与肝癌相关的新型长链非编码RNA HOTTIP。本研究探讨HOTTIP在肝癌中的表达模式,生物学功能及其对肝癌肝移植术后肿瘤复发的预测价值。方法：实时定量PCR检测肝癌肝移植病人肿瘤组织中HOTTIP的表达模式并分析其表达水平与肝移植术后肿瘤复发的关系。在体外实验中,应用小干扰RNA特异性降低HOTTIP的表达后,观察肝癌细胞活性、凋亡、侵袭能力等恶性生物学行为的变化。应用人全基因组表达谱芯片研究HOTTIP表达降低后对基因表达的影响,筛选和验证潜在下游靶点。结果：HOTTIP在Huh7、MHCC97H、MHCC97L肝癌细胞系中的表达较正常肝细胞系明显增高,同时HOTTIP在肝癌组织中较癌旁组织显示了明显的高表达。肝癌组织中HOTTIP高表达者移植术后肿瘤无复发生存率及总体生存率较低表达者明显降低,同时在超越米兰标准的肝癌肝移植病人中,HOTTIP高表达者也显示了较低的术后无复发生存率。多因素分析显示HOTTIP高表达是肝癌肝移植术后肿瘤复发及预后的独立危险因素。体外研究表明,小干扰RNA降低肝癌细胞HOTTIP的表达后,肿瘤细胞的侵袭能力明显减弱,同时也增强了肿瘤细胞对多柔比星、依托泊苷及奥沙利铂的化疗敏感性。表达谱芯片及生物信息学分析提示WNT信号通路可能是HOTTIP介导的一条重要通路。进一步的验证表明下调HOTTIP的表达能显著降低肝癌细胞非经典WNT通路中Wnt-5α的表达水平。结论：HOTTIP是肝癌复发转移的一个重要分子,介导Wnt-5α通路调控肝癌细胞抗凋亡、化疗增敏、迁移和侵袭等恶性生物学行为。HOTTIP的表达可作为一个预测肝癌肝移植术后肿瘤复发、预后的潜在生物学标志物。第三部分长链非编码RNA HOTAIR通过RNA结合蛋白38调控肝癌细胞侵袭转移并预测移植术后肝癌复发目的：长链非编码RNA在表观遗传学修饰中发挥重要作用。本研究目标为阐明长链非编码RNA家族新成员HOTAIR在肝癌复发转移中的生物学功能及其表观遗传学改变,揭示HOTAIR表观遗传调控肝癌侵袭转移的分子机制。方法：通过实时定量PCR检测HOTAIR在肝癌组织中的表达,研究HOTAIR与肝癌临床病理特征及预后的关系；应用siRNA干扰技术降低HOTAIR基因的表达,研究其降低对肝癌细胞恶性生物学行为的作用；应用人全基因组表达谱芯片技术研究HOTAIR表观调控的分子机制。结果：HOTAIR在BEL-7402、HepG2等肝癌细胞系中的表达较正常肝细胞系明显增高。体外研究表明,小干扰RNA降低肝癌细胞HOTAIR的表达后,肿瘤细胞的活力、迁移和侵袭能力明显减弱,同时也增强了肿瘤细胞对TNF-a介导的凋亡及顺铂、多柔比星等化疗药物的敏感性。应用人全基因组表达谱芯片和生物信息学分析,发现众多RNA结合蛋白参与其中。对siHOTAIR进行下游基因的筛选验证,我们发现RNA结合蛋白38是HOTAIR表观调控的潜在下游分子。HOTAIR通过下调RBM38的表达从而促进肝癌细胞的侵袭和转移。临床样本研究显示：HOTAIR在肝癌组织中较癌旁组织显著高表达。肝癌组织中HOTAIR高表达者预示肝癌肝移植术后无复发生存率及总体生存率较低。Cox多因素分析显示HOTAIR高表达是预测肝癌复发和预后的独立的危险因素。在超越米兰标准的肝癌肝移植病人中,HOTAIR高表达者也显示了较低的术后无复发生存率及总体生存率。结论：HOTAIR参与调控肝癌细胞增殖、凋亡、化疗增敏、迁移和侵袭等恶性生物学行为。HOTAIR通过下调RBM38的表达从而促进肝癌细胞的侵袭和转移。HOTAIR对肝癌肝移植术后肿瘤复发及预后预测具有潜在的临床应用价值。第四部分长链非编码RNA PCAT-1在肝癌肝移植术后肿瘤复发、预后中的预测作用目的：肝移植术后肿瘤复发是亟待解决的瓶颈问题。然而目前还缺乏有效的预测分子。本研究旨在阐明PCAT-1在肝癌中的表达水平,临床意义及生物学功能。方法：我们通过实时荧光定量PCR检测184例肝癌肝移植病人肿瘤组织中PCAT-1的表达模式,并分析其表达水平与肝移植术后肿瘤复发、生存的关系。在体外实验中,应用小干扰RNA特异性降低BEL-7402肝癌细胞株PCAT-1的表达后,观察肝癌细胞增殖、侵袭等恶性生物学行为的变化。结果：与癌旁组织相比,PCAT-1在肝癌组织中的表达明显增高,临床病理关联分析显示PCAT-1的表达水平与肿瘤数目、大小、术前AFP、临床病理分级等均无关。Cox多因素分析显示PCAT-1的高表达是肝癌肝移植术后肿瘤复发的独立预测因素。同时在符合米兰标准的肝癌肝移植病人中,PCAT-1高表达者显示了较低的术后无复发生存率和总体生存率。体外实验证实,BEL-7402敲低PCAT-1表达能显著抑制肿瘤细胞活性以及迁移侵袭能力,增强对缺氧、饥饿、化疗药物等介导的凋亡。结论：肝癌组织中高表达PCAT-1是预测移植术后肿瘤复发、预后的新型生物标志物,可能作为药物干预的新靶点。联合Milan标准和PCAT-1的表达,更加优化肝癌患者的分层。