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摘 要：乙肝血清标志物是临床常用的检测项目，常用的检测方法为酶联免疫吸附试验(ELISA)。在日常工作中，影响其检测的因素较多，常出现一些临床和实验室解释困难的结果或者在不同的医院甚至同一医院内结果不具有可比性，因此保证ELISA检测结果的可靠性显得尤为重要。本文现就其ELISA法检测乙肝血清标志物在实际操作中易出现的问题和质量控制措施加以分析。
关键词：乙肝血清标志物；酶联免疫吸附试验；质量控制
中图分类号：R512.6+2 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)05-084-02
乙肝感染呈全球性分布，可能半数以上世界人口曾受感染，每年发生5000万例新感染，每年100万人死亡。由此可见，我国乙肝流行状况十分严峻。但是在检测乙肝病毒标志物时要注意假阳性和假阴性结果的出现，不能因假阳性引起患者的心理压力和精神痛苦，造成不必要的纠纷。也不能出现假阴性结果，以利于患者的早发现、早诊断、早治疗。乙型肝炎病毒血清学标志物(HBVM)是目前临床分析和判断乙型肝炎病毒感染病程及其传染性的重要依据，常用方法是ELISA法，其商品试剂盒和自动或半自动酶标检测仪现已经在各级医院临床检验中普及应用。现阶段，由于我国ELISA法检测乙肝血清学标志物多采取手工方式操作，影响因素较多，为保证测定结果的准确性和可靠性，实验室必须重视质量管理，下面就我们在实际工作中的体会汇报如下。
1 乙肝标志物ELISA检测过程中的影响因素分析
首先是，试剂盒的质量和试剂的运输与贮存。试剂盒质量是关系到ELISA检测结果准确度的核心问题，目前我国生产ELISA试剂盒的厂家众多，产品质量也参差不齐。资料显示，不同厂家试剂的敏感性为89.4%~99.3%，存在较大差异。同时ELISA试剂盒热稳定性差，遇热后灵敏度、特异性都将降低。而ELISA试剂盒的货架寿命只有6个月，这样就要求试剂盒在4~10℃下运输贮存，各实验室在贮存环节上都能达到要求。但目前在炎热的夏季无法保证试剂盒的冷链运输。试剂盒经过几天的长途高温运输，其货架寿命将消耗殆尽，如各实验室还按说明书的有效期使用至6个月，检测结果的准确性将无法保证。其次是检测过程中的操作失误，如加样标本离心去血清或血浆时分离不好，有红细胞、标本溶血或相邻标本加样时污染。孵育时未封闭，造成标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁难以洗清。孵育时间人为延长，造成非特异性结合紧附于反应孔周围，难以洗清。手工洗板时，孔与孔之问相互污染。洗板不完全，未洗净，反应板过多造成洗板等待时间延长。显色显色剂放置时间过长、使用过期显色剂或加显色剂时溅出孔外造成液体回流。
影响ELISA法检测乙肝标志物的因素很多，除上述因素外还与内源、外源物质的干扰有关，检测室的环境与质控体系及使用者素质等都影响到检测质量。
2 加强乙肝标志物ELISA检测质量控制的措施
2.1 建立质量控制标准
首先是检测人员要参加质控学习班和学术交流，积极参加关于质量控制的学习交流，统一认识，了解质量控制方面的动态和进展，分析失控的原因，找出差距，制定整改措施，实施于实际工作中。其次要注重临界值血清的使用。所谓临界值就是阴性和阳性的临界值，当达到这一水平时，必须采取某些医疗措施。工作中应把临界值血清做成阳性结果，以此来保证实验的可靠性，临界值血清具有以下优点：其含量低，是界于阴性的弱阳性血清，为低值阳性标本的检出提供参照。该血清显示结果时颜色较浅，但肉眼可以分辨出与阴性对照不同，这就增加了一个判断何时终止酶促反应的标准。该血清有利于提高不同实验室结果的可比性。所以，临界值血清的使用，可以避免低值阳性标本，建立统一的标准，提高不同实验室结果的可比性。
2.2 注重测量前的质量控制
首先要保证ELISA实验仪器的准备妥当，包括加样器和酶标仪的校准和洗板机的工作状态完好。由于多采用商品化试剂盒，不同厂家的产品质量参差不齐，所以必须选择中华医学会检验学会推荐的产品，具有国家卫生部正式批准号，其灵敏度、特异性、精密性、稳定性都满意的试剂盒。在选定试剂后，还必须注意在试剂的有效期内使用，不同厂家产品不能混用，对每批试剂必须抽样进行评价。另外根据我们的经验，最好长期使用一家中华医学会推荐公司的产品，这样不仅便于保证结果具有一定的稳定性还便于发现试剂的质量问题，以便及时更换和取得公司的技术支持。同时必须遵守实验室内质控原则，经过严格选择的试剂进入实验室后，由于免疫试剂由生物活性物质制备而成，任何因素的变化均影响其质量和稳定性，如保存时间、运输条件等，因此，仍需实验室对其质量进行室内质控，最好使用两种不同浓度的质控血清，这样才能保证检测质量。制定“三查七对把七关、全部机洗+质控”的检测质量控制等杜绝差错的具体措施。同时操作人员必须有一定的专业知识和实践经验，能认真贯彻质量控制的措施，有良好的职业道德和责任心。
2.3 严格操作
我们要按试剂盒说明书的要求准备实验中需用试剂。蒸馏水要新鲜，从冰箱取出试剂应待温度与室温平衡后再使用，试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。加样器在使用前必需经过校对方可使用，加样时力度要求一致所加样品应加在板孔底部，避免加在孔壁上部，并注意不可浅出，不可产生气泡。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。一切加量均须准确，微量加液器长期使用后弹簧硬度和密封性变差，影响吸取标本的准确性，须定期校正加液器，尤其是加显色剂和中止剂的量不准确时，将带入较大的误差，建议使用电子加样器。严格按操作规程控制温度及反应时间，因为温度高则破坏了酶的活性，温度过低则反应不完全，反应时间过短会直接影响酶的吸附作用。洗涤在ELISA法试验过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELISA法就是靠洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中，非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。因而洗涤时，洗液要新鲜，注满各孔又不使洗液流出，静置1~2min，扣干水分，再进行下一次。洗涤完毕将板在吸水纸上扣干再显色。显色是ELISA法的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随着时间的延长而呈色加强，一些弱阳性的标本可显示强阳性。另外滴加显色剂时，瓶子要垂直，A液B液的量要相等，以免影响测出的值。在比色时，选好所需的波长，擦干板上的水份。
2.4 测量后的质量管理
严格按照说明书判定结果。必须通过酶标仪读取吸光度值，计算出S/CO，按照说明书所标示的公式判定阴、阳性结果，肉眼观察结果容易引起误判。质控血清检测的结果绘制Levey-Jennings质控图，限度应在1-2SD内，如一次超过±3SD或连续两次超过±2SD为失控。当出现乙型肝炎病毒血清学标志物罕见的模式时，应首先排除“HOOK”效应以及高浓度类风湿因子、补体及嗜异性抗体等内源性因素的干扰所导致的误差，通过对血清标本的处理如血清标本加入IgM抗体来中和类风湿因子，或者用2-巯基乙醇加入标本稀释液中使类风湿因子降解；另外用EDTA稀释标本或者用53℃、10分钟加热血清能在一定程度上消除干扰。如果是操作因素的原因如血液凝固不全，血清中还含有纤维蛋白导致的假阳性，可将标本重新离心后取血清进行复查的方式得到解决，同时检测报告发出前必须认真审核，杜绝差错。
总之，影响ELISA检测的因素众多，检验人员一定要有高度的责任心，要注意假阴性、假阳性结果的出现，对可疑标本一定要进行复检，以有利于患者的早发现、早诊断、早治疗，采取必要的防护措施，为临床提供正确可靠的检测结果。
参考文献：
[1] 张彦，邓文桤，蒋涛.广东省内常见乙肝检测ELISA试剂的抽样调查[J].数理医药学，1996，9(4)：352.
[2] 许斌，朱虎定.ELISA检测HBsAg影响因素的探讨[J].临床检验，2000，18(4)：232.
[3] 耿素敏.84消毒液对ELISA法显色的影响[J].上海医学检验，1998，13(4)：241.
[4] 许斌，朱虎定.ELISA检测HBSAG影响因素的探讨[J].临床检验，2000，18(4)：232.
[5] 裴丽娜，康明淑.溶血血清对检测己肝五项指标的影响[J].中国疗养医学，1999，8(3)：59~60.
[6] 宋宏先，张吉才，郭建华.即刻法室内质控存在的问题探讨[J].检验医学，2004，19(3)：269~270.
[7] 陈慧英，张锦锋，陆银华，等.改良即刻法用于酶联免疫吸附试验室内质量控制的探索[J].检验医学，2006，21(2)：159~162.
(责任编辑：万贤贤)
关键词：乙肝血清标志物；酶联免疫吸附试验；质量控制
中图分类号：R512.6+2 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)05-084-02
乙肝感染呈全球性分布，可能半数以上世界人口曾受感染，每年发生5000万例新感染，每年100万人死亡。由此可见，我国乙肝流行状况十分严峻。但是在检测乙肝病毒标志物时要注意假阳性和假阴性结果的出现，不能因假阳性引起患者的心理压力和精神痛苦，造成不必要的纠纷。也不能出现假阴性结果，以利于患者的早发现、早诊断、早治疗。乙型肝炎病毒血清学标志物(HBVM)是目前临床分析和判断乙型肝炎病毒感染病程及其传染性的重要依据，常用方法是ELISA法，其商品试剂盒和自动或半自动酶标检测仪现已经在各级医院临床检验中普及应用。现阶段，由于我国ELISA法检测乙肝血清学标志物多采取手工方式操作，影响因素较多，为保证测定结果的准确性和可靠性，实验室必须重视质量管理，下面就我们在实际工作中的体会汇报如下。
1 乙肝标志物ELISA检测过程中的影响因素分析
首先是，试剂盒的质量和试剂的运输与贮存。试剂盒质量是关系到ELISA检测结果准确度的核心问题，目前我国生产ELISA试剂盒的厂家众多，产品质量也参差不齐。资料显示，不同厂家试剂的敏感性为89.4%~99.3%，存在较大差异。同时ELISA试剂盒热稳定性差，遇热后灵敏度、特异性都将降低。而ELISA试剂盒的货架寿命只有6个月，这样就要求试剂盒在4~10℃下运输贮存，各实验室在贮存环节上都能达到要求。但目前在炎热的夏季无法保证试剂盒的冷链运输。试剂盒经过几天的长途高温运输，其货架寿命将消耗殆尽，如各实验室还按说明书的有效期使用至6个月，检测结果的准确性将无法保证。其次是检测过程中的操作失误，如加样标本离心去血清或血浆时分离不好，有红细胞、标本溶血或相邻标本加样时污染。孵育时未封闭，造成标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁难以洗清。孵育时间人为延长，造成非特异性结合紧附于反应孔周围，难以洗清。手工洗板时，孔与孔之问相互污染。洗板不完全，未洗净，反应板过多造成洗板等待时间延长。显色显色剂放置时间过长、使用过期显色剂或加显色剂时溅出孔外造成液体回流。
影响ELISA法检测乙肝标志物的因素很多，除上述因素外还与内源、外源物质的干扰有关，检测室的环境与质控体系及使用者素质等都影响到检测质量。
2 加强乙肝标志物ELISA检测质量控制的措施
2.1 建立质量控制标准
首先是检测人员要参加质控学习班和学术交流，积极参加关于质量控制的学习交流，统一认识，了解质量控制方面的动态和进展，分析失控的原因，找出差距，制定整改措施，实施于实际工作中。其次要注重临界值血清的使用。所谓临界值就是阴性和阳性的临界值，当达到这一水平时，必须采取某些医疗措施。工作中应把临界值血清做成阳性结果，以此来保证实验的可靠性，临界值血清具有以下优点：其含量低，是界于阴性的弱阳性血清，为低值阳性标本的检出提供参照。该血清显示结果时颜色较浅，但肉眼可以分辨出与阴性对照不同，这就增加了一个判断何时终止酶促反应的标准。该血清有利于提高不同实验室结果的可比性。所以，临界值血清的使用，可以避免低值阳性标本，建立统一的标准，提高不同实验室结果的可比性。
2.2 注重测量前的质量控制
首先要保证ELISA实验仪器的准备妥当，包括加样器和酶标仪的校准和洗板机的工作状态完好。由于多采用商品化试剂盒，不同厂家的产品质量参差不齐，所以必须选择中华医学会检验学会推荐的产品，具有国家卫生部正式批准号，其灵敏度、特异性、精密性、稳定性都满意的试剂盒。在选定试剂后，还必须注意在试剂的有效期内使用，不同厂家产品不能混用，对每批试剂必须抽样进行评价。另外根据我们的经验，最好长期使用一家中华医学会推荐公司的产品，这样不仅便于保证结果具有一定的稳定性还便于发现试剂的质量问题，以便及时更换和取得公司的技术支持。同时必须遵守实验室内质控原则，经过严格选择的试剂进入实验室后，由于免疫试剂由生物活性物质制备而成，任何因素的变化均影响其质量和稳定性，如保存时间、运输条件等，因此，仍需实验室对其质量进行室内质控，最好使用两种不同浓度的质控血清，这样才能保证检测质量。制定“三查七对把七关、全部机洗+质控”的检测质量控制等杜绝差错的具体措施。同时操作人员必须有一定的专业知识和实践经验，能认真贯彻质量控制的措施，有良好的职业道德和责任心。
2.3 严格操作
我们要按试剂盒说明书的要求准备实验中需用试剂。蒸馏水要新鲜，从冰箱取出试剂应待温度与室温平衡后再使用，试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。加样器在使用前必需经过校对方可使用，加样时力度要求一致所加样品应加在板孔底部，避免加在孔壁上部，并注意不可浅出，不可产生气泡。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。一切加量均须准确，微量加液器长期使用后弹簧硬度和密封性变差，影响吸取标本的准确性，须定期校正加液器，尤其是加显色剂和中止剂的量不准确时，将带入较大的误差，建议使用电子加样器。严格按操作规程控制温度及反应时间，因为温度高则破坏了酶的活性，温度过低则反应不完全，反应时间过短会直接影响酶的吸附作用。洗涤在ELISA法试验过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELISA法就是靠洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中，非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。因而洗涤时，洗液要新鲜，注满各孔又不使洗液流出，静置1~2min，扣干水分，再进行下一次。洗涤完毕将板在吸水纸上扣干再显色。显色是ELISA法的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随着时间的延长而呈色加强，一些弱阳性的标本可显示强阳性。另外滴加显色剂时，瓶子要垂直，A液B液的量要相等，以免影响测出的值。在比色时，选好所需的波长，擦干板上的水份。
2.4 测量后的质量管理
严格按照说明书判定结果。必须通过酶标仪读取吸光度值，计算出S/CO，按照说明书所标示的公式判定阴、阳性结果，肉眼观察结果容易引起误判。质控血清检测的结果绘制Levey-Jennings质控图，限度应在1-2SD内，如一次超过±3SD或连续两次超过±2SD为失控。当出现乙型肝炎病毒血清学标志物罕见的模式时，应首先排除“HOOK”效应以及高浓度类风湿因子、补体及嗜异性抗体等内源性因素的干扰所导致的误差，通过对血清标本的处理如血清标本加入IgM抗体来中和类风湿因子，或者用2-巯基乙醇加入标本稀释液中使类风湿因子降解；另外用EDTA稀释标本或者用53℃、10分钟加热血清能在一定程度上消除干扰。如果是操作因素的原因如血液凝固不全，血清中还含有纤维蛋白导致的假阳性，可将标本重新离心后取血清进行复查的方式得到解决，同时检测报告发出前必须认真审核，杜绝差错。
总之，影响ELISA检测的因素众多，检验人员一定要有高度的责任心，要注意假阴性、假阳性结果的出现，对可疑标本一定要进行复检，以有利于患者的早发现、早诊断、早治疗，采取必要的防护措施，为临床提供正确可靠的检测结果。
参考文献：
[1] 张彦，邓文桤，蒋涛.广东省内常见乙肝检测ELISA试剂的抽样调查[J].数理医药学，1996，9(4)：352.
[2] 许斌，朱虎定.ELISA检测HBsAg影响因素的探讨[J].临床检验，2000，18(4)：232.
[3] 耿素敏.84消毒液对ELISA法显色的影响[J].上海医学检验，1998，13(4)：241.
[4] 许斌，朱虎定.ELISA检测HBSAG影响因素的探讨[J].临床检验，2000，18(4)：232.
[5] 裴丽娜，康明淑.溶血血清对检测己肝五项指标的影响[J].中国疗养医学，1999，8(3)：59~60.
[6] 宋宏先，张吉才，郭建华.即刻法室内质控存在的问题探讨[J].检验医学，2004，19(3)：269~270.
[7] 陈慧英，张锦锋，陆银华，等.改良即刻法用于酶联免疫吸附试验室内质量控制的探索[J].检验医学，2006，21(2)：159~162.
(责任编辑：万贤贤)