论文部分内容阅读
摘要：目的：探讨小分子化合物Z36联合S8对肿瘤细胞的自噬和死亡的影响，进一步认识分子靶向药物的联用在抗肿瘤中的应用。方法：台盼蓝染色和流式细胞仪检测Z36单独处理和Z36联合S8处理后细胞死亡率和坏死细胞数，激光共聚焦荧光显微镜观察GFP-LC3点状聚集变化和通过免疫印迹法检测LC3-II蛋白表达的变化，探讨Z36联合S8对自噬和死亡的影响。结果：Z36与S8联合处理后，HeLa细胞死亡率显著升高(P<0.05)，细胞发生坏死。S8明显地促进了Z36对HeLa细胞的毒性,其促进作用具有S8的剂量依赖性。但联合用药并未降低Z36引起的自噬，LC3-II蛋白表达也未发生变化。结论：Z36联合使用S8后，并不影响Z36诱导的细胞自噬，而促进了Z36诱导的细胞坏死，S8可能与自噬无关的途径促进Z36诱导的细胞死亡。
关键词：S8 Z36 联合用药 坏死 自噬
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1879(2012)03-0004-01
S8是一种脂肪酸合成酶的特异性抑制剂，Z36是一种新型的靶向抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL的小分子化合物抑制物［1］。根据以往的报道，靶向Bcl-2/Bcl-XL小分子如ABT-737与obatoclax均是通过诱导细胞凋亡方式促进肿瘤细胞死亡［2-4］。而在本实验室的前期结果发现，Z36则是能够诱导细胞发生自噬性死亡［1］。随着分子靶向药物开发和应用，具有高特异性和高选择性诱导肿瘤细胞凋亡的小分子化合物的联合使用已经得到了广泛的关注，如脂肪酸合成酶对靶向Bcl-2/Bcl-XL的小分子ABT-737诱导细胞发生凋亡具有增敏效果［5］。药物联用在抗肿瘤疗效中的思路和疗效已经成为近几年抗肿瘤新药的研究热点。目前，Z36与S8联合用药的效应和机制均尚未探明，本文通过研究S8与Z36药物联用后的抗肿瘤效应，探讨S8对Z36诱导的细胞自噬和死亡的影响，为进一步研究靶向小分子化合物联合用药后的抗肿瘤效应和探讨作用机制提供有力的参考价值。
1 材料与方法
1.1 材料。胎牛血清（旭日公司）；培养基（Hyaclon）；LipofectamineTM2000（Invitrogen）；GFP-LC3（Addgene）；LC3抗体（西格玛）；RIPA裂解液（碧云天）；Annex V-FIT C/PI试剂盒（BD公司）；β-actin（世纪康为）；Z36由军事医学科学院合成［1］。
1.2 细胞培养和转染。HeLa细胞用10%胎牛血清-DMEM培养基（含10 U/mL的青霉素、0.1 mg /ml的链霉素）在37°C，5% CO2细胞培养箱中进行培养。细胞按照LipofectamineTM2000 转染试剂的步骤说明进行转染操作。
1.3 免疫印迹法。冰上裂解30 分钟，离心手机上清进行蛋白电泳。5%脱脂奶粉封闭，TBS洗3次之后，一抗4 °C 孵育过夜。TBS洗3次，二抗结合HRP-山羊抗兔IgG (1:5 000) 2 h，TBS洗3次。暗室内X光片感光、显影、定影、观察。
1.4 流式细胞仪检测细胞死亡率和死亡方式。
死亡率：收集细胞同上，然后进行台盼蓝染色，统计死细胞比例。死亡方式：收集的细胞分别加入PI和Annexin V避光孵育15 分钟，PBS洗2遍，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率和坏死率。每组实验重复3次。
2 结果
2.1 单独用药和联合用药的对细胞死亡的影响。Z36在10 μM浓度以上单独用药时细胞毒性明显，而5 μM以下并未诱导HeLa细胞的死亡(Fig 1Aa)。根据S8的细胞毒性实验结果，30 μM以下的S8没有明显的毒性(Fig1Ab)。选取无毒性的低浓度S8进行药物联用处理。当Z36分别与15 μM和30 μM两个低浓度的S8联合处理后，细胞毒性明显增强，死亡率显著升高（P＜0.05），并且这种由Z36和S8联合用药死亡率的增高呈S8剂量依赖性(Fig1Ac-d)。流式细胞仪检测结果表明，S8+Z36联合用药和Z36 单独用药均诱导细胞发生坏死，死亡方式一致(Fig1B)。
2.2 单独用药和联合用药对细胞自噬的影响。在转染了GFP-LC3的HeLa细胞中，S8与Z36联合用药和Z36单独用药的细胞中均能观察到明显的GFP-LC3点状聚集的发生(Fig 2Aa)，而两组细胞在GFP-LC3点状聚集的细胞比例和单细胞内GFP-LC3的点状聚集数量无显著的差异(Fig 2Ab-c)。
免疫印迹法检测S8与Z36联合用药和Z36单独用药处理HeLa细胞后LC3I向LC3II的转变。结果表明，两组细胞中均能检测到明显的LC3I向LC3II的转变，并且两组间无明显的差别(Fig 2D)。以上结果说明，S8与Z36的联合用药并未影响Z36诱导的细胞自噬水平。
3 讨论
靶向抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL的小分子化合物往往诱导细胞凋亡［2,3］，但是Z36则是诱导细胞发生自噬性死亡。脂肪酸合成酶抑制剂能够启动凋亡［6］，与Z36联合用药则是促进细胞坏死，且未改变Z36诱导的自噬水平。以上的结果表明，在联合用药过程中，S8促进Z36诱导的细胞死亡与其自噬的激活与否无关。这种联合用药的机制有别于其他靶向抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL的小分子化合物与脂肪酸合成酶抑制剂联合用药的作用机制，甚至可能更为复杂。S8和Z36联合用药的分子机制还有待深入的研究。
参考文献
［1］ Lin J,Zheng Z,Li Y,et al.A novel Bcl-XL inhibitor Z36 that induces autophagic cell death in Hela cells.Autophagy 2009;5:314-320
［2］ Romani AA,Desenzani S,Morganti MM,et al.The BH3-mimetic ABT-737 targets the apoptotic machinery in cholangiocarcinoma cell lines resulting in synergistic interactions with zoledronic acid.Cancer Chemother Pharmacol 2011;67:557-567
［3］ van Delft MF,Wei AH,Mason KD,et al.The BH3 mimetic ABT-737 targets selective Bcl-2 proteins and efficiently induces apoptosis via Bak/Bax if Mcl-1 is neutralized.Cancer Cell 2006;10:389-399
［4］ Konopleva M,Watt J,Contractor R,et al.Mechanisms of antileukemic activity of the novel Bcl-2 homology domain-3 mimetic GX15-070 (obatoclax).Cancer Res 2008;68:3413-3420
［5］ Samudio I,Harmancey R,Fiegl M,et al.Pharmacologic inhibition of fatty acid oxidation sensitizes human leukemia cells to apoptosis induction.J Clin Invest 2010;120:142-156
［6］ Zhou W,Simpson PJ,McFadden JM,et al.Fatty acid synthase inhibition triggers apoptosis during S phase in human cancer cells.Cancer Res 2003;63:7330-7337
关键词：S8 Z36 联合用药 坏死 自噬
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1879(2012)03-0004-01
S8是一种脂肪酸合成酶的特异性抑制剂，Z36是一种新型的靶向抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL的小分子化合物抑制物［1］。根据以往的报道，靶向Bcl-2/Bcl-XL小分子如ABT-737与obatoclax均是通过诱导细胞凋亡方式促进肿瘤细胞死亡［2-4］。而在本实验室的前期结果发现，Z36则是能够诱导细胞发生自噬性死亡［1］。随着分子靶向药物开发和应用，具有高特异性和高选择性诱导肿瘤细胞凋亡的小分子化合物的联合使用已经得到了广泛的关注，如脂肪酸合成酶对靶向Bcl-2/Bcl-XL的小分子ABT-737诱导细胞发生凋亡具有增敏效果［5］。药物联用在抗肿瘤疗效中的思路和疗效已经成为近几年抗肿瘤新药的研究热点。目前，Z36与S8联合用药的效应和机制均尚未探明，本文通过研究S8与Z36药物联用后的抗肿瘤效应，探讨S8对Z36诱导的细胞自噬和死亡的影响，为进一步研究靶向小分子化合物联合用药后的抗肿瘤效应和探讨作用机制提供有力的参考价值。
1 材料与方法
1.1 材料。胎牛血清（旭日公司）；培养基（Hyaclon）；LipofectamineTM2000（Invitrogen）；GFP-LC3（Addgene）；LC3抗体（西格玛）；RIPA裂解液（碧云天）；Annex V-FIT C/PI试剂盒（BD公司）；β-actin（世纪康为）；Z36由军事医学科学院合成［1］。
1.2 细胞培养和转染。HeLa细胞用10%胎牛血清-DMEM培养基（含10 U/mL的青霉素、0.1 mg /ml的链霉素）在37°C，5% CO2细胞培养箱中进行培养。细胞按照LipofectamineTM2000 转染试剂的步骤说明进行转染操作。
1.3 免疫印迹法。冰上裂解30 分钟，离心手机上清进行蛋白电泳。5%脱脂奶粉封闭，TBS洗3次之后，一抗4 °C 孵育过夜。TBS洗3次，二抗结合HRP-山羊抗兔IgG (1:5 000) 2 h，TBS洗3次。暗室内X光片感光、显影、定影、观察。
1.4 流式细胞仪检测细胞死亡率和死亡方式。
死亡率：收集细胞同上，然后进行台盼蓝染色，统计死细胞比例。死亡方式：收集的细胞分别加入PI和Annexin V避光孵育15 分钟，PBS洗2遍，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率和坏死率。每组实验重复3次。
2 结果
2.1 单独用药和联合用药的对细胞死亡的影响。Z36在10 μM浓度以上单独用药时细胞毒性明显，而5 μM以下并未诱导HeLa细胞的死亡(Fig 1Aa)。根据S8的细胞毒性实验结果，30 μM以下的S8没有明显的毒性(Fig1Ab)。选取无毒性的低浓度S8进行药物联用处理。当Z36分别与15 μM和30 μM两个低浓度的S8联合处理后，细胞毒性明显增强，死亡率显著升高（P＜0.05），并且这种由Z36和S8联合用药死亡率的增高呈S8剂量依赖性(Fig1Ac-d)。流式细胞仪检测结果表明，S8+Z36联合用药和Z36 单独用药均诱导细胞发生坏死，死亡方式一致(Fig1B)。
2.2 单独用药和联合用药对细胞自噬的影响。在转染了GFP-LC3的HeLa细胞中，S8与Z36联合用药和Z36单独用药的细胞中均能观察到明显的GFP-LC3点状聚集的发生(Fig 2Aa)，而两组细胞在GFP-LC3点状聚集的细胞比例和单细胞内GFP-LC3的点状聚集数量无显著的差异(Fig 2Ab-c)。
免疫印迹法检测S8与Z36联合用药和Z36单独用药处理HeLa细胞后LC3I向LC3II的转变。结果表明，两组细胞中均能检测到明显的LC3I向LC3II的转变，并且两组间无明显的差别(Fig 2D)。以上结果说明，S8与Z36的联合用药并未影响Z36诱导的细胞自噬水平。
3 讨论
靶向抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL的小分子化合物往往诱导细胞凋亡［2,3］，但是Z36则是诱导细胞发生自噬性死亡。脂肪酸合成酶抑制剂能够启动凋亡［6］，与Z36联合用药则是促进细胞坏死，且未改变Z36诱导的自噬水平。以上的结果表明，在联合用药过程中，S8促进Z36诱导的细胞死亡与其自噬的激活与否无关。这种联合用药的机制有别于其他靶向抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL的小分子化合物与脂肪酸合成酶抑制剂联合用药的作用机制，甚至可能更为复杂。S8和Z36联合用药的分子机制还有待深入的研究。
参考文献
［1］ Lin J,Zheng Z,Li Y,et al.A novel Bcl-XL inhibitor Z36 that induces autophagic cell death in Hela cells.Autophagy 2009;5:314-320
［2］ Romani AA,Desenzani S,Morganti MM,et al.The BH3-mimetic ABT-737 targets the apoptotic machinery in cholangiocarcinoma cell lines resulting in synergistic interactions with zoledronic acid.Cancer Chemother Pharmacol 2011;67:557-567
［3］ van Delft MF,Wei AH,Mason KD,et al.The BH3 mimetic ABT-737 targets selective Bcl-2 proteins and efficiently induces apoptosis via Bak/Bax if Mcl-1 is neutralized.Cancer Cell 2006;10:389-399
［4］ Konopleva M,Watt J,Contractor R,et al.Mechanisms of antileukemic activity of the novel Bcl-2 homology domain-3 mimetic GX15-070 (obatoclax).Cancer Res 2008;68:3413-3420
［5］ Samudio I,Harmancey R,Fiegl M,et al.Pharmacologic inhibition of fatty acid oxidation sensitizes human leukemia cells to apoptosis induction.J Clin Invest 2010;120:142-156
［6］ Zhou W,Simpson PJ,McFadden JM,et al.Fatty acid synthase inhibition triggers apoptosis during S phase in human cancer cells.Cancer Res 2003;63:7330-7337