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[摘要]目的：观察Q开关激光不同能量照射对黄褐斑动物模型黑素细胞的增殖、黑素生成及酪氨酸酶活性的影响。方法：用Q开关激光不同能量照射黄褐斑动物模型，取表皮黑素细胞进行细胞培养，采用MTT法测定细胞活力的影响；氢氧化钠裂解法测定黑素的含量；体外多巴氧化反应法测定酪氨酸活性的变化；光学显微镜观察细胞形态学变化。结果：除高能高频组外各能量密度和频率组激光照射后即刻黑素细胞形态无明显变化。第5次治疗后高能量密度照射组明显可见黑素细胞数目减少、体积变小、树突数量减少，长度缩短。而低能量高频率照射组仅黑素细胞体积变小，树突数量减少，长度缩短。与术前比较，低能量低频率照射组黑素细胞增殖、黑素含量、酪氨酸活性无显著差异，但其他三组显著性下降。然而，3周术后黑素细胞增殖、黑素含量、酪氨酸活性增强趋势，有显著性意义（P [关键词]激光；黑素细胞；黑素生成；酪氨酸酶；动物模型
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）11-1178-06
黑素由位于基底层的黑素细胞合成，黑素合成的类型和数量以及在角质形成细胞周围的分布决定皮肤的颜色[1]，但表皮中过多的黑素会使皮肤颜色变深从而带来美容问题，黑素合成是酪氨酸酶催化的系列氧化还原反应。抑制酪氨酸酶活性和抑制黑素细胞代谢的物质，一直是皮肤美白及治疗色素增多性疾病的主要策略[2]。虽然Q开关激光在治疗色素增加性皮肤病取得较好疗效[3]，但仍存在色素脱失和治疗后反跳的风险[4]，查阅文献，大量实验研究显示不同能量密度的Q开关激光照射体外培养的人表皮黑素细胞对黑素合成、酪氨酸酶活性有一定的影响。但激光对活体表皮黑素细胞照射的影响和光生物学作用尚不十分清楚，因此，我们通过动物实验初步探讨Q开关激光对体内黑素细胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1实验动物： 根据文献[5]制作慢性应激肝郁型豚鼠黄褐斑实验动物模型12只。
1.1.2主要试剂和仪器：RPMI1640培养基、标准胎牛血清、 磷酸缓冲盐溶液（PBS）（美国 GibcoBRL 公司）；HMGS 添加剂（美国Cascade Biologics公司）；胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、0.25%胰蛋白酶、TritonX-100、NAOH（美国Sigma 公司）；D-Hanks溶液（美国Hyclone公司）；bFGF（珠海东大制药）、转铁蛋白（北方同正公司）；Dispase酶（日本三光纯药株式会社）；ABC试剂盒（博士德）； 倒置显微镜（日本Nikon公司），酶联免疫分析仪（美国Bio-Rad公司）；台式微型离心机；紫外分光光度计（美国Beckman Coulter 公司）；Q-switched Nd：YAG 激光仪（Medlite C6，美国HoYa-ConBio公司）
1.2实验方法
1.2.1照射方法：取慢性应激肝郁型豚鼠黄褐斑实验动物模型造模12只，将每只小鼠背部裸露色斑皮肤（8cm×8cm）划分成A（左上区域）、B（右上区域）、C（左下区域）、D（右下区域）四个区域。分别代表不同参数治疗区。A区代表高能量低频率区：3mm光斑 2.5J/cm2，频率1Hz；B区代表高能量高频率区：3mm光斑，2.5J/cm2，频率10Hz；C区代表低能量高频率区：3mm光斑，1.5J/cm2，频率10Hz；D 区代表低能量低频率区：3mm光斑，1.5J/cm2，频率1Hz。每组照射1min，每周照射一次，共照射5次。实验设每只豚鼠自身激光术前为对照。
1.2.2取材方法： 分别于激光治疗术前，第1次术后即刻、第5次术后即刻、术后1周、术后3周五次分别切取不同治疗区约1.0cm×0.2cm全层去毛皮肤一条，术后丝线缝合。根据组织病理和细胞培养观察需要进行处理保存。
1.2.3 细胞培养
1.2.3.1标本的分离和细胞悬液的制备[6-7]：取下的豚鼠皮肤组织用0.05%洗必泰浸泡消毒10min；生理盐水漂洗数遍，剪成5mm×2mm的小块；0.25%的DispaseⅡ酶4℃消化（16～24h）；用镊子将表皮与真皮分离；将表皮组织置于0.25%的胰蛋白酶中室温消化10min；用吸管反复吹打成单细胞；待瓶内液体混浊时加入与胰酶等量的含10%胎牛血清终止消化；100目筛网过滤；吸取细胞悬液于离心管中，1 000r/min离心10min；弃上清，加入RPMI1640培养液重悬细胞，1 000 r/min 离心10 min；弃上清，加入黑素细胞培养液（MGM，用RPMI1640培养配制，内含 20μm/mlbFGF、10%FCS、CT250ng/ml、转铁蛋白10μg/ml、氢化考的松3μg/ml、胰岛素0.15U/ml、100 U/ml青霉素、100mg/ml链霉素）培养。吹打成单细胞悬液，计数细胞。
1.2.3.2 传代培养：将上述制备的细胞悬液接种于25cm2培养瓶中，调整密度为2×104/cm2，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，24h首次换液，每48h换液1次。当细胞生长至70%～80%融合时进行传代。每一次实验取自同一传代细胞，取对数生长期细胞，常规消化，台盼蓝染色法计数活细胞数，根据实验需要分别接种于96 孔板（密度为2×104/ml，每孔100μl，每组设3个复孔）与直径60mm 培养瓶（密度为1×106/ml），继续培养48h后以备下列实验所用。
1.3 测定方法
1.3.1 黑素细胞增殖影响的测定[8]：采用MTT法测定，取第2代对数生长期细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至2×104/ml， 按每孔100μl接种于96孔板，每孔加入20μl MTT溶液（浓度为5g/l，用PBS稀释）37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入150μlDMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解，设立4个实验组，各组各时间点设立3个复孔，术前单纯细胞（A值）作为对照组，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值（A值）。计算黑素细胞增殖率=照射组值A490/对照组值A490×100%。 1.3.2 黑素细胞黑素生成影响的测定[9]：采用NAOH溶解法，取第2代对数生长期的黑素细胞，将处理后的黑素细胞弃去上清液。PBS洗3次，用含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶消化3min 后，接种及分组同上。然后加入100μl的1mmol/L的NAOH溶液中，37℃孵育1h后，各管加入400μl 的蒸馏水稀释后，用酶标仪测定490nm波长（A）值。根据公式计算黑素相对含量=照射组值A490/对照组值A490×100%。
1.3.3 黑素细胞酪氨酸酶活性的影响测定[8]：氧化多巴反应法测定酪氨酸酶活性，细胞接种与分组同黑素含量测定。取第2代对数生长期细胞，弃培养基，以PBS洗涤2次，每孔加1%TriontX-100溶液50μl，-80℃冻融使细胞破裂，加入1%L-DOPA溶液100μl，37℃反应3h，酶联免疫分析仪测定490nm波长的吸光度值（A）。酪氨酸酶相对活性=照射组值A490/对照组值A490×100%。
1.3.4 细胞形态观察：倒置显微镜观察激光照射后各组培养黑素细胞的形态变化。
1.4 数据统计分析：SPSS17.0统计学软件，数据以（x±s）表示，计量数据采用t检验。组间差异运用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Q-switched Nd： YAG 激光照射后对黑素细胞的形态学观察：倒置显微镜下观察传代培养的第二代豚鼠黑素细胞形态呈树突状，两极或多极，不规则排列，部分区域连接成网状。各组第1次照射后即刻除高能高频组黑素细胞轻微减少外无明显变化，5次激光照射后一周，低能高频组未明显可见黑素细胞减少，但体积变小、树突长度减少。高能高频和高能低频照射组可见黑素细胞减少、体积变小、树突长度减少。5次激光照射术后3周，低能高频组黑素细胞体积变大，树突延长，两极，三极。低能低频组经过5次照射后无明显变化（图1）。
2.2 黑素细胞增殖的影响：采用重复测量资料的方差分析，与照射前相比高能高频组、高能低频组和低能高频组黑素细胞增殖率显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）。不同激光照射组在不同时段的变化趋势不同。高能高频组与照射前比较在第1次激光术后即刻黑素细胞增殖率下降，差异有统计学意义（P<0.01）。低能高频组在第5次术后即刻黑素细胞增殖率明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。并且不同照射组间下降分值不同，高能高频组较其他组下降显著，差异有统计学意义（P<0.01）。低能低频经5次照射后与照射前相比，差异无统计学意义（P>0.05）见表1、图2。
2.3 黑素细胞黑素生成的影响：采用重复测量资料的方差分析，与照射前相比高能高频组、高能低频组和低能高频组黑素含量显著下降，差异具有统计学意义（P<0.01）。不同激光照射组在不同时段的变化趋势不同。高能高频组与照射前比较在第1次激光照射后即刻黑素含量下降，差异有统计学意义（P<0.01）。低能高频组在第5次照射后即刻黑素含量明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。并且不同照射组间下降分值不同，高能高频组较其他组下降显著，差异有统计学意义（P<0.01）。低能低频经5次照射后与照射前相比，差异无统计学意义（P>0.05）见表2、图3。
2.4黑素细胞酪氨酸酶活性的影响：采用重复测量资料的方差分析，与照射前相比高能高频组、高能低频组和低能高频组酪氨酸酶活性显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）。不同激光照射组在不同时段的变化趋势不同。高能高频组与照射前比较在第1次激光照射后即刻酪氨酸酶活性下降，差异有统计学意义（P<0.01）。低能高频组在第5次照射后即刻酪氨酸酶活性明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。并且不同照射组间下降分值不同，高能高频组较其他组下降显著，差异有统计学意义（P<0.01）。低能低频经5次照射后与照射前相比，差异无统计学意义（P>0.05）见表3、图4。
3 讨论
近些年，医用激光技术迅猛发展，在色素性皮肤病的治疗中发挥着非常重要的作用。现阶段Q开关Nd： YAG激光治疗色素增加性皮肤病的机理主要是选择性光热作用理论，但Q开关Nd： YAG激光对黑素细胞黑素合成影响的机制却并不清楚。通过不同能量密度的Q开关Nd：YAG激光对体外培养的人表皮黑素细胞照射实验表明[10]，高能量抑制黑素细胞的黑素合成，而低能量则促进。动物实验也表明[11]，激光能量较低时，可促进黑色素合成，能量较高时抑制黑色素的合成。黑素的合成是个极其复杂的过程，在体内受金属离子、激素、酪氨酸酶等各种因素的调节，但体内和体外是否存在着差异，为我们提出更多的疑问。但这些结果和临床现象为我们的研究提供了理论基础与实验手段和思路。本课题中我们通过观察Q开关Nd：YAG激光照射活体黄褐斑豚鼠模型，并分次取材培养模型表皮黑素细胞研究其对细胞增殖、黑素合成的影响。
实验结果显示与其他组相比高能高频组经第一次照射后即可抑制黑素细胞的增殖，降低酪氨酸酶活性及降低黑素合成量。表明在单位时间内靶目标接受到的照射能量足够大时，黑素细胞吸收的累积热量同样会达到一定的温度，从而导致对黑素细胞的损伤和影响。低能高频组通过多次照射后才显示出对黑素细胞合成功能的抑制作用。表明低能量密度随着多次能量密度的累加，增强到某一程度时才对黑素细胞产生一定的损伤或影响。而低能低频组经过5次照射后无明显变化。更加表明了黑素细胞是可以耐受一定能量密度范围内的照射。激光照射的能量密度只有累积达到一定阈值时，才会对黑素细胞产生影响。由此推论不论高能量或低能量当超过一定耐受阈值时都会对黑素细胞产生影响或损伤，不仅是对色素颗粒的爆破，也能抑制黑素细胞的增殖，降低酪氨酸酶活性及降低黑素合成量。高能量时可能直接导致黑素细胞的损伤或减少，而低能量照射是能量累积的结果。从而解释了临床上Q开关Nd：YAG 1064nm 激光大光斑、小能量、多次治疗黄褐斑引起色素减退的现象[12]，随着累加能量的增多，超过了黑素细胞的耐受阈值。近来大量国内外研究表明，大光斑、低能量多次治疗与高能量、小光斑少次治疗疗效一致，但减少了不良反应的发生[13-14]，本研究结果与之相符。Griflies[15]对2l例黄褐斑患者的研究则认为黄褐斑皮损区黑素细胞数量并无改变，其色素增加主要是由于黑素合成及转运障碍的缘故。结合我们近期临床使用大光斑，小能量，高频率，多次治疗的方式治疗黄褐斑的经验，说明该方法是以通过对黑素细胞合成功能抑制的原理。 通过术后3周的观察，无论高能量还是低能量导致的这种损伤都是可逆性的，黑素细胞会随着时间的延长进行自我修复。另一方面也解释了在修复过程中如果黑素细胞活性增强就有可能出现治疗后色素反跳性增加的临床现象。Liew 等[16]认为，激光治疗后的色素脱失和色素减退是由于黑素合成的抑制，而并没有基底层黑素细胞数量的改变。但根据实验结果分析，在一定的能量密度和频率条件下激光不仅破坏了黑素小体，同时还可以明显抑制黑素的合成。而且过强的能量密度和频率任然会损伤黑素细胞，导致色减的发生。这一点可以提示我们，如果我们在临床上需要使用高能量对色素颗粒进行爆破时，应避免能量过高，减少对黑素细胞的损伤。通过实验结果可以指导我们临床中面对黑素细胞合成功能增加色素性疾病时如黄褐斑、PIH等，使用低能量、高频率多次治疗的方法，抑制黑素细胞的合成功能达到治疗目的。仅表现色素颗粒增多色素性疾病如太田痣、褐青色痣等，可以使用高能量、低频率治疗，爆破色素颗粒促进组织吸收。因此临床上选用Q开关 Nd：YAG 激光治疗色素增加性疾病时对于能量密度与频率的选择非常重要。
[参考文献]
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[收稿日期]2013-04-11 [修回日期]2013-05-26
编辑/张惠娟
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）11-1178-06
黑素由位于基底层的黑素细胞合成，黑素合成的类型和数量以及在角质形成细胞周围的分布决定皮肤的颜色[1]，但表皮中过多的黑素会使皮肤颜色变深从而带来美容问题，黑素合成是酪氨酸酶催化的系列氧化还原反应。抑制酪氨酸酶活性和抑制黑素细胞代谢的物质，一直是皮肤美白及治疗色素增多性疾病的主要策略[2]。虽然Q开关激光在治疗色素增加性皮肤病取得较好疗效[3]，但仍存在色素脱失和治疗后反跳的风险[4]，查阅文献，大量实验研究显示不同能量密度的Q开关激光照射体外培养的人表皮黑素细胞对黑素合成、酪氨酸酶活性有一定的影响。但激光对活体表皮黑素细胞照射的影响和光生物学作用尚不十分清楚，因此，我们通过动物实验初步探讨Q开关激光对体内黑素细胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1实验动物： 根据文献[5]制作慢性应激肝郁型豚鼠黄褐斑实验动物模型12只。
1.1.2主要试剂和仪器：RPMI1640培养基、标准胎牛血清、 磷酸缓冲盐溶液（PBS）（美国 GibcoBRL 公司）；HMGS 添加剂（美国Cascade Biologics公司）；胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、0.25%胰蛋白酶、TritonX-100、NAOH（美国Sigma 公司）；D-Hanks溶液（美国Hyclone公司）；bFGF（珠海东大制药）、转铁蛋白（北方同正公司）；Dispase酶（日本三光纯药株式会社）；ABC试剂盒（博士德）； 倒置显微镜（日本Nikon公司），酶联免疫分析仪（美国Bio-Rad公司）；台式微型离心机；紫外分光光度计（美国Beckman Coulter 公司）；Q-switched Nd：YAG 激光仪（Medlite C6，美国HoYa-ConBio公司）
1.2实验方法
1.2.1照射方法：取慢性应激肝郁型豚鼠黄褐斑实验动物模型造模12只，将每只小鼠背部裸露色斑皮肤（8cm×8cm）划分成A（左上区域）、B（右上区域）、C（左下区域）、D（右下区域）四个区域。分别代表不同参数治疗区。A区代表高能量低频率区：3mm光斑 2.5J/cm2，频率1Hz；B区代表高能量高频率区：3mm光斑，2.5J/cm2，频率10Hz；C区代表低能量高频率区：3mm光斑，1.5J/cm2，频率10Hz；D 区代表低能量低频率区：3mm光斑，1.5J/cm2，频率1Hz。每组照射1min，每周照射一次，共照射5次。实验设每只豚鼠自身激光术前为对照。
1.2.2取材方法： 分别于激光治疗术前，第1次术后即刻、第5次术后即刻、术后1周、术后3周五次分别切取不同治疗区约1.0cm×0.2cm全层去毛皮肤一条，术后丝线缝合。根据组织病理和细胞培养观察需要进行处理保存。
1.2.3 细胞培养
1.2.3.1标本的分离和细胞悬液的制备[6-7]：取下的豚鼠皮肤组织用0.05%洗必泰浸泡消毒10min；生理盐水漂洗数遍，剪成5mm×2mm的小块；0.25%的DispaseⅡ酶4℃消化（16～24h）；用镊子将表皮与真皮分离；将表皮组织置于0.25%的胰蛋白酶中室温消化10min；用吸管反复吹打成单细胞；待瓶内液体混浊时加入与胰酶等量的含10%胎牛血清终止消化；100目筛网过滤；吸取细胞悬液于离心管中，1 000r/min离心10min；弃上清，加入RPMI1640培养液重悬细胞，1 000 r/min 离心10 min；弃上清，加入黑素细胞培养液（MGM，用RPMI1640培养配制，内含 20μm/mlbFGF、10%FCS、CT250ng/ml、转铁蛋白10μg/ml、氢化考的松3μg/ml、胰岛素0.15U/ml、100 U/ml青霉素、100mg/ml链霉素）培养。吹打成单细胞悬液，计数细胞。
1.2.3.2 传代培养：将上述制备的细胞悬液接种于25cm2培养瓶中，调整密度为2×104/cm2，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，24h首次换液，每48h换液1次。当细胞生长至70%～80%融合时进行传代。每一次实验取自同一传代细胞，取对数生长期细胞，常规消化，台盼蓝染色法计数活细胞数，根据实验需要分别接种于96 孔板（密度为2×104/ml，每孔100μl，每组设3个复孔）与直径60mm 培养瓶（密度为1×106/ml），继续培养48h后以备下列实验所用。
1.3 测定方法
1.3.1 黑素细胞增殖影响的测定[8]：采用MTT法测定，取第2代对数生长期细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至2×104/ml， 按每孔100μl接种于96孔板，每孔加入20μl MTT溶液（浓度为5g/l，用PBS稀释）37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入150μlDMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解，设立4个实验组，各组各时间点设立3个复孔，术前单纯细胞（A值）作为对照组，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值（A值）。计算黑素细胞增殖率=照射组值A490/对照组值A490×100%。 1.3.2 黑素细胞黑素生成影响的测定[9]：采用NAOH溶解法，取第2代对数生长期的黑素细胞，将处理后的黑素细胞弃去上清液。PBS洗3次，用含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶消化3min 后，接种及分组同上。然后加入100μl的1mmol/L的NAOH溶液中，37℃孵育1h后，各管加入400μl 的蒸馏水稀释后，用酶标仪测定490nm波长（A）值。根据公式计算黑素相对含量=照射组值A490/对照组值A490×100%。
1.3.3 黑素细胞酪氨酸酶活性的影响测定[8]：氧化多巴反应法测定酪氨酸酶活性，细胞接种与分组同黑素含量测定。取第2代对数生长期细胞，弃培养基，以PBS洗涤2次，每孔加1%TriontX-100溶液50μl，-80℃冻融使细胞破裂，加入1%L-DOPA溶液100μl，37℃反应3h，酶联免疫分析仪测定490nm波长的吸光度值（A）。酪氨酸酶相对活性=照射组值A490/对照组值A490×100%。
1.3.4 细胞形态观察：倒置显微镜观察激光照射后各组培养黑素细胞的形态变化。
1.4 数据统计分析：SPSS17.0统计学软件，数据以（x±s）表示，计量数据采用t检验。组间差异运用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Q-switched Nd： YAG 激光照射后对黑素细胞的形态学观察：倒置显微镜下观察传代培养的第二代豚鼠黑素细胞形态呈树突状，两极或多极，不规则排列，部分区域连接成网状。各组第1次照射后即刻除高能高频组黑素细胞轻微减少外无明显变化，5次激光照射后一周，低能高频组未明显可见黑素细胞减少，但体积变小、树突长度减少。高能高频和高能低频照射组可见黑素细胞减少、体积变小、树突长度减少。5次激光照射术后3周，低能高频组黑素细胞体积变大，树突延长，两极，三极。低能低频组经过5次照射后无明显变化（图1）。
2.2 黑素细胞增殖的影响：采用重复测量资料的方差分析，与照射前相比高能高频组、高能低频组和低能高频组黑素细胞增殖率显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）。不同激光照射组在不同时段的变化趋势不同。高能高频组与照射前比较在第1次激光术后即刻黑素细胞增殖率下降，差异有统计学意义（P<0.01）。低能高频组在第5次术后即刻黑素细胞增殖率明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。并且不同照射组间下降分值不同，高能高频组较其他组下降显著，差异有统计学意义（P<0.01）。低能低频经5次照射后与照射前相比，差异无统计学意义（P>0.05）见表1、图2。
2.3 黑素细胞黑素生成的影响：采用重复测量资料的方差分析，与照射前相比高能高频组、高能低频组和低能高频组黑素含量显著下降，差异具有统计学意义（P<0.01）。不同激光照射组在不同时段的变化趋势不同。高能高频组与照射前比较在第1次激光照射后即刻黑素含量下降，差异有统计学意义（P<0.01）。低能高频组在第5次照射后即刻黑素含量明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。并且不同照射组间下降分值不同，高能高频组较其他组下降显著，差异有统计学意义（P<0.01）。低能低频经5次照射后与照射前相比，差异无统计学意义（P>0.05）见表2、图3。
2.4黑素细胞酪氨酸酶活性的影响：采用重复测量资料的方差分析，与照射前相比高能高频组、高能低频组和低能高频组酪氨酸酶活性显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）。不同激光照射组在不同时段的变化趋势不同。高能高频组与照射前比较在第1次激光照射后即刻酪氨酸酶活性下降，差异有统计学意义（P<0.01）。低能高频组在第5次照射后即刻酪氨酸酶活性明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。并且不同照射组间下降分值不同，高能高频组较其他组下降显著，差异有统计学意义（P<0.01）。低能低频经5次照射后与照射前相比，差异无统计学意义（P>0.05）见表3、图4。
3 讨论
近些年，医用激光技术迅猛发展，在色素性皮肤病的治疗中发挥着非常重要的作用。现阶段Q开关Nd： YAG激光治疗色素增加性皮肤病的机理主要是选择性光热作用理论，但Q开关Nd： YAG激光对黑素细胞黑素合成影响的机制却并不清楚。通过不同能量密度的Q开关Nd：YAG激光对体外培养的人表皮黑素细胞照射实验表明[10]，高能量抑制黑素细胞的黑素合成，而低能量则促进。动物实验也表明[11]，激光能量较低时，可促进黑色素合成，能量较高时抑制黑色素的合成。黑素的合成是个极其复杂的过程，在体内受金属离子、激素、酪氨酸酶等各种因素的调节，但体内和体外是否存在着差异，为我们提出更多的疑问。但这些结果和临床现象为我们的研究提供了理论基础与实验手段和思路。本课题中我们通过观察Q开关Nd：YAG激光照射活体黄褐斑豚鼠模型，并分次取材培养模型表皮黑素细胞研究其对细胞增殖、黑素合成的影响。
实验结果显示与其他组相比高能高频组经第一次照射后即可抑制黑素细胞的增殖，降低酪氨酸酶活性及降低黑素合成量。表明在单位时间内靶目标接受到的照射能量足够大时，黑素细胞吸收的累积热量同样会达到一定的温度，从而导致对黑素细胞的损伤和影响。低能高频组通过多次照射后才显示出对黑素细胞合成功能的抑制作用。表明低能量密度随着多次能量密度的累加，增强到某一程度时才对黑素细胞产生一定的损伤或影响。而低能低频组经过5次照射后无明显变化。更加表明了黑素细胞是可以耐受一定能量密度范围内的照射。激光照射的能量密度只有累积达到一定阈值时，才会对黑素细胞产生影响。由此推论不论高能量或低能量当超过一定耐受阈值时都会对黑素细胞产生影响或损伤，不仅是对色素颗粒的爆破，也能抑制黑素细胞的增殖，降低酪氨酸酶活性及降低黑素合成量。高能量时可能直接导致黑素细胞的损伤或减少，而低能量照射是能量累积的结果。从而解释了临床上Q开关Nd：YAG 1064nm 激光大光斑、小能量、多次治疗黄褐斑引起色素减退的现象[12]，随着累加能量的增多，超过了黑素细胞的耐受阈值。近来大量国内外研究表明，大光斑、低能量多次治疗与高能量、小光斑少次治疗疗效一致，但减少了不良反应的发生[13-14]，本研究结果与之相符。Griflies[15]对2l例黄褐斑患者的研究则认为黄褐斑皮损区黑素细胞数量并无改变，其色素增加主要是由于黑素合成及转运障碍的缘故。结合我们近期临床使用大光斑，小能量，高频率，多次治疗的方式治疗黄褐斑的经验，说明该方法是以通过对黑素细胞合成功能抑制的原理。 通过术后3周的观察，无论高能量还是低能量导致的这种损伤都是可逆性的，黑素细胞会随着时间的延长进行自我修复。另一方面也解释了在修复过程中如果黑素细胞活性增强就有可能出现治疗后色素反跳性增加的临床现象。Liew 等[16]认为，激光治疗后的色素脱失和色素减退是由于黑素合成的抑制，而并没有基底层黑素细胞数量的改变。但根据实验结果分析，在一定的能量密度和频率条件下激光不仅破坏了黑素小体，同时还可以明显抑制黑素的合成。而且过强的能量密度和频率任然会损伤黑素细胞，导致色减的发生。这一点可以提示我们，如果我们在临床上需要使用高能量对色素颗粒进行爆破时，应避免能量过高，减少对黑素细胞的损伤。通过实验结果可以指导我们临床中面对黑素细胞合成功能增加色素性疾病时如黄褐斑、PIH等，使用低能量、高频率多次治疗的方法，抑制黑素细胞的合成功能达到治疗目的。仅表现色素颗粒增多色素性疾病如太田痣、褐青色痣等，可以使用高能量、低频率治疗，爆破色素颗粒促进组织吸收。因此临床上选用Q开关 Nd：YAG 激光治疗色素增加性疾病时对于能量密度与频率的选择非常重要。
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[收稿日期]2013-04-11 [修回日期]2013-05-26
编辑/张惠娟