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摘要：以酵母EGY48为材料，研究了不同培养时间（12、16、20、24、30h）、细胞状态（OD600）、电击电压（600、800、1000、1200、1400V）及不同质粒DNA用量（1、2、5、10、15、20μg）对酵母电击转化效率的影响。结果表明：当培养时间为20h、OD600=1.4、电击电压为1000V、质粒用量为5μg时，该系统转化效率最高，为后续高效文库的筛选奠定了基础。
关键词：酵母；电击转化；转化效率
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）01-0029-03
酵母菌（Saccharomycescerevisiae）作为单细胞真核生物，是传统食品工业的主要用菌，近年来更是低等真核生物基因工程表达的重要菌种。由于具有生长快、易于培养和遗传操作、具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物加工修饰及分泌的能力等优点，酵母在基因工程的表达系统中日益受到重视。外源基因进入酵母菌一般采用遗传转化的方法，1978年Himmen等[1]和Beggs[2]分别报道了酵母菌原生质体转化法，该方法转化率较高，但需要脱去细胞壁进行转化后再生，步骤比较繁琐，不利于转化子的快速制备。随后Ito等[3]建立了完整酵母转化法，该方法简捷，但转化率偏低。1985年，Karube等[4]和Hashimoto等[5]分别利用电击法转化酵母原生质体及完整细胞获得成功后，电击转化法以其高转化率、操作方便等优点越来越受到重视。现在，电转化技术不断提高，已被广泛用于酵母细胞外源基因导入中[5～11]。本试验以酵母EGY48为材料，研究了影响酵母电击转化的几个因素，以期建立一套高效、简便的酵母外源基因转化系统，为进一步基因工程研究提供保障。
1材料与方法
1.1材料与试剂
酵母菌株：EGY48，为本实验室保存；质粒：pLEXAD，为本实验室保存。
YPD液体培养基：2%蛋白胨，1%酵母粉，2%葡萄糖；选择培养基：SD/His-/Leu-培养基。各种培养用主要试剂和抗生素购自Promega公司；质粒提取试剂盒购自北京天根公司；其它化学药品为国产分析纯。
1.2试验方法
1.2.1感受态酵母的制备挑取直径为2～3mm的酵母单菌落于内有5mlYPD培养液的10ml摇管中，30℃、230～250r/min振荡培养12～24h；取上述菌液0.5ml加入到内有500mlYPD培养液的1L三角瓶中，30℃、230～250r/min分别振荡培养12、16、20、24、30h，测其OD600值；1500×g、4℃离心5min，弃上清，收集菌体；用500ml预冷的无菌水重悬；1500×g、4℃离心5min，弃上清，收集菌体；用250ml预冷的无菌水重悬；1500×g、4℃离心5min，弃上清，收集菌体；用20ml预冷的1mol/L山梨醇重悬；1500×g、4℃离心5min，弃上清，收集菌体；用1ml预冷的1mol/L山梨醇溶解，使终体积约为1.5ml；每管分装80μl，备用。
1.2.2酵母电击转化取不同体积一定浓度的质粒DNA，使其终用量分别为1、2、5、10、15、20μg，分别加入80μl感受态细胞中，转入0.2cm预冷的电击杯中，冰上放置5min；采用伯乐电穿孔仪电击，电压分别设定600、800、1000、1200、1400V，电容25μF，电阻400Ω；后向电击杯中立即加入1ml预冷的1mol/L山梨醇，转入1.5ml无菌离心管中；取200～600μl涂平板，30℃倒置培养3～6d，直至出现菌落。
2结果与分析
2.1不同培养时间对酵母转化率的影响
将酵母分别培养12、16、20、24、30h后进行转化，此时电压采用1000V，质粒DNA用量为2μg，其他条件均相同。统计结果（图1）表明：不同培养时间对平均转化率的影响较大，培养20h、OD600值约为1.4的酵母转化效果比较理想，平均转化率最高，可达3.62×105转化子/μgDNA。
不同生长时期的酵母细胞对转化率影响较大，本研究的结果显示，处于对数生长中期的酵母细胞生长旺盛，该时期电击转化效果明显高于稳定期的细胞，推测可能是由于处于对数生长中期的酵母细胞壁结构疏松，更利于进行电击转化。对于感受态酵母的制备，建议现制现用，从而保证较高的转化率。一般认为，电击转化是通过触发细胞膜使其电通透性增大，瞬间形成小孔，从而使各种生物大分子进出细胞[14，15]。电压较低时，细胞不容易瞬间形成微孔通道，质粒DNA等生物大分子难以进入细胞，无法完成转化；电压过高，则会导致大部分细胞因小孔形成较大，难以复原而死亡，降低了酵母细胞的存活率，也影响了转化率。本试验条件下，电压为1000V时，酵母转化率最大。质粒DNA的用量对电击转化率也有一定的影响，原因可能是当质粒DNA浓度较低时，电击产生的细胞小孔可以允许大部分的DNA分子进入细胞；但当质粒DNA用量增大，超过最大容纳值时，细胞能吸收的DNA分子达到极限饱和状态，反而降低了转化率。
根据本试验方法，培养时间为20h、OD600=1.4、电击电压为1000V、质粒用量为5μg时，该系统转化效率最为理想，可以满足电击转化试验要求，为后续高效文库的筛选奠定了基础。
参考文献：
[1]HinnenA，HicksJB，FinkJR.TransformationofYeast[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1978，75：1929-1933.
[2]BeggsJD.TransformationofYeastbyaReplicationHybridPlasmid[J].Nature，1978，275：104-109. [3]ItoH，FukudaY，MurataK，etal.TransformationofIntactYeastCellsTreatedwithAlkaliCations[J].J.Bacteriol.，1983，153（1）：163-168.
[4]KarubeI，TamiyaE，MatsuokaH.TransformationofSaccharomycecerevisiaespheroplastsbyhighelectricpulse[J].FEBSLetts.，1985，182：90-94.
[5]HashimotoH，MorijawaH，YamataY，etal.AnovelmethodfortransformationofintactyeastcellsbyelectroinjectionofplasmidDNA[J].AppliedMicrobiol.Biotechnol.，1985；2：336-339.
[6]徐志武，张颖，王智学，等.一种高效的酿酒酵母和毕赤酵母电击转化法[J].中山大学学报（自然科学版），2010，49（3）：98-
101.
[7]高炳淼，唐天乐，长孙东亭，等.毕赤酵母高效电转化条件的研究[J].中国海洋药物，2010，2：1-5.
[8]金筱耘，赵爱春，李军，等.Monellin-EGFP融合蛋白在毕赤酵母中的表达[J].食品科学，2012，33（13）：171-175.
[9]郭春和，焦茂兴，何俊，等.抗菌肽CecropinD基因在毕赤酵母中的表达与抗菌活性分析[J].中国预防兽医学报，2011，33（11）：858-861.
[10]朱永梅，曹永生，李鑫，等.鹅干扰素-α的毕赤酵母表达及其生物学活性分析[J].中国兽医科学，2013，43（4）：401-406.
[11]苏岚，曾令兵，周勇，等.草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白在毕赤酵母中表达的初步研究[J].淡水渔业，2012，42（6）：38-42.
[12]奥斯伯F，金斯顿RE，塞德曼JG，等著.精编分子生物学实验指南[M].颜子颖，王海林译，金冬雁校.北京：科学出版社，1998，23-24.
[13]方勤，田静.电转化法提高平连载体DNA转化效率的研究[J].生物技术，1999，9（4）：5-8.
[14]MeihocE，MassonJM，TeissieJ.Highefficiencytransformationofintactyeastcelllsbyelectricfieldpulses[J].Biotechnol.，1990，8（3）：223-227.
[15]秦玉静，金建玲，鲍晓明，等.影响酿酒酵母电击转化率的条件[J].山东大学学报（自然科学版），1999，2：236-240.
关键词：酵母；电击转化；转化效率
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）01-0029-03
酵母菌（Saccharomycescerevisiae）作为单细胞真核生物，是传统食品工业的主要用菌，近年来更是低等真核生物基因工程表达的重要菌种。由于具有生长快、易于培养和遗传操作、具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物加工修饰及分泌的能力等优点，酵母在基因工程的表达系统中日益受到重视。外源基因进入酵母菌一般采用遗传转化的方法，1978年Himmen等[1]和Beggs[2]分别报道了酵母菌原生质体转化法，该方法转化率较高，但需要脱去细胞壁进行转化后再生，步骤比较繁琐，不利于转化子的快速制备。随后Ito等[3]建立了完整酵母转化法，该方法简捷，但转化率偏低。1985年，Karube等[4]和Hashimoto等[5]分别利用电击法转化酵母原生质体及完整细胞获得成功后，电击转化法以其高转化率、操作方便等优点越来越受到重视。现在，电转化技术不断提高，已被广泛用于酵母细胞外源基因导入中[5～11]。本试验以酵母EGY48为材料，研究了影响酵母电击转化的几个因素，以期建立一套高效、简便的酵母外源基因转化系统，为进一步基因工程研究提供保障。
1材料与方法
1.1材料与试剂
酵母菌株：EGY48，为本实验室保存；质粒：pLEXAD，为本实验室保存。
YPD液体培养基：2%蛋白胨，1%酵母粉，2%葡萄糖；选择培养基：SD/His-/Leu-培养基。各种培养用主要试剂和抗生素购自Promega公司；质粒提取试剂盒购自北京天根公司；其它化学药品为国产分析纯。
1.2试验方法
1.2.1感受态酵母的制备挑取直径为2～3mm的酵母单菌落于内有5mlYPD培养液的10ml摇管中，30℃、230～250r/min振荡培养12～24h；取上述菌液0.5ml加入到内有500mlYPD培养液的1L三角瓶中，30℃、230～250r/min分别振荡培养12、16、20、24、30h，测其OD600值；1500×g、4℃离心5min，弃上清，收集菌体；用500ml预冷的无菌水重悬；1500×g、4℃离心5min，弃上清，收集菌体；用250ml预冷的无菌水重悬；1500×g、4℃离心5min，弃上清，收集菌体；用20ml预冷的1mol/L山梨醇重悬；1500×g、4℃离心5min，弃上清，收集菌体；用1ml预冷的1mol/L山梨醇溶解，使终体积约为1.5ml；每管分装80μl，备用。
1.2.2酵母电击转化取不同体积一定浓度的质粒DNA，使其终用量分别为1、2、5、10、15、20μg，分别加入80μl感受态细胞中，转入0.2cm预冷的电击杯中，冰上放置5min；采用伯乐电穿孔仪电击，电压分别设定600、800、1000、1200、1400V，电容25μF，电阻400Ω；后向电击杯中立即加入1ml预冷的1mol/L山梨醇，转入1.5ml无菌离心管中；取200～600μl涂平板，30℃倒置培养3～6d，直至出现菌落。
2结果与分析
2.1不同培养时间对酵母转化率的影响
将酵母分别培养12、16、20、24、30h后进行转化，此时电压采用1000V，质粒DNA用量为2μg，其他条件均相同。统计结果（图1）表明：不同培养时间对平均转化率的影响较大，培养20h、OD600值约为1.4的酵母转化效果比较理想，平均转化率最高，可达3.62×105转化子/μgDNA。
不同生长时期的酵母细胞对转化率影响较大，本研究的结果显示，处于对数生长中期的酵母细胞生长旺盛，该时期电击转化效果明显高于稳定期的细胞，推测可能是由于处于对数生长中期的酵母细胞壁结构疏松，更利于进行电击转化。对于感受态酵母的制备，建议现制现用，从而保证较高的转化率。一般认为，电击转化是通过触发细胞膜使其电通透性增大，瞬间形成小孔，从而使各种生物大分子进出细胞[14，15]。电压较低时，细胞不容易瞬间形成微孔通道，质粒DNA等生物大分子难以进入细胞，无法完成转化；电压过高，则会导致大部分细胞因小孔形成较大，难以复原而死亡，降低了酵母细胞的存活率，也影响了转化率。本试验条件下，电压为1000V时，酵母转化率最大。质粒DNA的用量对电击转化率也有一定的影响，原因可能是当质粒DNA浓度较低时，电击产生的细胞小孔可以允许大部分的DNA分子进入细胞；但当质粒DNA用量增大，超过最大容纳值时，细胞能吸收的DNA分子达到极限饱和状态，反而降低了转化率。
根据本试验方法，培养时间为20h、OD600=1.4、电击电压为1000V、质粒用量为5μg时，该系统转化效率最为理想，可以满足电击转化试验要求，为后续高效文库的筛选奠定了基础。
参考文献：
[1]HinnenA，HicksJB，FinkJR.TransformationofYeast[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1978，75：1929-1933.
[2]BeggsJD.TransformationofYeastbyaReplicationHybridPlasmid[J].Nature，1978，275：104-109. [3]ItoH，FukudaY，MurataK，etal.TransformationofIntactYeastCellsTreatedwithAlkaliCations[J].J.Bacteriol.，1983，153（1）：163-168.
[4]KarubeI，TamiyaE，MatsuokaH.TransformationofSaccharomycecerevisiaespheroplastsbyhighelectricpulse[J].FEBSLetts.，1985，182：90-94.
[5]HashimotoH，MorijawaH，YamataY，etal.AnovelmethodfortransformationofintactyeastcellsbyelectroinjectionofplasmidDNA[J].AppliedMicrobiol.Biotechnol.，1985；2：336-339.
[6]徐志武，张颖，王智学，等.一种高效的酿酒酵母和毕赤酵母电击转化法[J].中山大学学报（自然科学版），2010，49（3）：98-
101.
[7]高炳淼，唐天乐，长孙东亭，等.毕赤酵母高效电转化条件的研究[J].中国海洋药物，2010，2：1-5.
[8]金筱耘，赵爱春，李军，等.Monellin-EGFP融合蛋白在毕赤酵母中的表达[J].食品科学，2012，33（13）：171-175.
[9]郭春和，焦茂兴，何俊，等.抗菌肽CecropinD基因在毕赤酵母中的表达与抗菌活性分析[J].中国预防兽医学报，2011，33（11）：858-861.
[10]朱永梅，曹永生，李鑫，等.鹅干扰素-α的毕赤酵母表达及其生物学活性分析[J].中国兽医科学，2013，43（4）：401-406.
[11]苏岚，曾令兵，周勇，等.草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白在毕赤酵母中表达的初步研究[J].淡水渔业，2012，42（6）：38-42.
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[13]方勤，田静.电转化法提高平连载体DNA转化效率的研究[J].生物技术，1999，9（4）：5-8.
[14]MeihocE，MassonJM，TeissieJ.Highefficiencytransformationofintactyeastcelllsbyelectricfieldpulses[J].Biotechnol.，1990，8（3）：223-227.
[15]秦玉静，金建玲，鲍晓明，等.影响酿酒酵母电击转化率的条件[J].山东大学学报（自然科学版），1999，2：236-240.