论文部分内容阅读
摘 要 针对海南省近几年来趋重发生的檀香炭疽病，通过对该病病原进行形态学观察，致病性测定及rDNA-ITS序列分析，并研究病原菌生物学特性。结果表明，檀香炭疽病病原为Colletotrichum fructicola，该菌菌丝及分生孢子均能在10～35 ℃条件下生长，且菌丝最适生长温度及分生孢子最适萌发温度为30 ℃。该菌菌丝生长能适应的pH值范围为4.0～11.0，最适pH值为6.0，分生孢子萌发pH范围为4.0～11.0，最适萌发pH为5.0，光照条件下最有利于菌丝的生长，而黑暗条件下有利于分生孢子的萌发。该病病原菌在以蔗糖、可溶性淀粉为碳源的培养基上生长较好，在以蛋白胨、尿素、酵母膏浸粉、硫酸铵为氮源的培养基上生长较好。
关键词 檀香；炭疽病；形态学；rDNA-ITS序列；生物学特性
中图分类号 S763.15 文献标识码 A
Abstract Santalum album L. anthracnose occurs much more seriously in some areas of Hainan. The aim of the research was to figure out the species of anthracnose on S. album L.， The pathogen was identified with its morphologic characters， pathogenicity and rDNA-ITS sequence analysis， and the biological characteristics of the pathogen was also studied. The results showed that C. fructicola was the pathogens of S. album L. anthracnose. The mycelium of pathogen could grow normally at 10～35 ℃， but the favorable temperature was 30 ℃. The conidia germinated at 10～35 ℃， but the optimum temperature was 30 ℃. Mycelia could grow normally on PDA of which pH was among 4.0～11.0， but the optimum pH was 6.0. The conidia could germinate at pH4.0～11.0， but the favorable pH was 5.0. Lightness was favorable for mycelial growth， and darkness was optimum for conidial germination. Sucrose carbon and soluble starch was suitable for mycelial growth， Among the tested media of the nitrogen sources， Czapka liquid medium containing peptone， urea nitrate， yeast extract powder or ammonium sulfate was favorable for mycelia growth.
Key words Santalum album L.； Anthracnose； Morphology； rDNA-ITS sequence； Biological characteristics
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.028
珍贵树种资源是全球重要的战略资源，其培育工作涉及到林业可持续发展战略乃至国家的长远利益[1]。檀香（Santalum album Linn.）是檀香科（Santalaceae）檀香属的一种半寄生小乔木，现被列为国家重点保护植物。檀香应用最广泛的为化妆品、梳妆用品、医药用品、芳香疗法用品。檀香还是良好的冷冻剂、收敛剂、退热剂，能用于治疗偏头痛、丹毒、淋病、膀胱炎等。檀香心材中提取的檀香油是配制高级香水、香精不可缺少的原料之一[2]。檀香属共有16个树种、15个变种，都为常绿半寄生的小乔木或灌木，心材都含有芳香性的檀香油。近几年来被广泛地商业性的引种栽培[2]，因此对檀香病害的研究与防治就显得至关重要。
檀香的主要病害有炭疽病、煤污病、苗木立枯病、根腐病、白粉病等。但在整个海南省病虫害调查过程中发现檀香炭疽病是危害檀香幼树生长的主要病害。感病初期叶片边缘或中心出现浅褐色的病斑，周围有浅紫色晕圈，随着病斑不断扩大，病斑处呈深灰褐色，且长满黑色的小点，病健交界处呈紫褐色。最后病斑处穿孔，造成植株提前落叶。关于檀香炭疽病，目前尚未有比较系统的研究，更无有效的林间防治措施。笔者从檀香炭疽病病原入手，在形态学鉴定和分子鉴定的基础上，深入研究了该病病原菌的生物学特性。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株：2013年5月从海南澄迈县国营澄迈林场采集到的檀香炭疽病样本进行常规组织分离和单胞纯化后[3]，得到供试菌株，移入斜面培养基中4 ℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 病原菌形态观察 将采集到的檀香病叶放入人工气候培养箱中，覆上保鲜膜，保湿培养几天后，用单面刀片将病斑处切成极薄的小片，从而制做成徒手切片，在显微镜下观察病原菌的菌丝形态。将供试菌株在新鲜PDA培养基上活化6 d后，用接种针挑取培养基表面菌丝及分生孢子做成临时玻片[4]，观察病原菌的菌丝、分生孢子的形态。 1.2.2 致病性测定 采用菌丝块活体接种。取生长健壮的檀香幼苗，用75%酒精消毒，再用无菌水冲洗2～3次，用打孔器（d=6 mm）打取已经活化好的供试菌株，用灭菌的接种环将菌丝块移至叶片上，使用空白琼脂块作为对照。放入人工气候培养箱中，并套上保鲜袋保湿培养。每株檀香幼苗接种4片叶片，共设5个重复。接种后24 h移去菌饼，连续观察接种叶片发病情况，并将发病部位进行再次分离，观察是否与接种菌一致。
1.2.3 病原菌DNA提取及rDNA-ITS扩增 将病原菌转入新鲜的培养基中，在28 ℃培养箱中活化5 d后，刮取菌丝于离心管中，使用天根快速提取试剂盒提取病原菌的总DNA[5]。采用真菌通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）扩增DNA。PCR反应体系（25 μL）：引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，Taq酶0.25 μL，Mix 12.5 μL，dNTPs 1 μL，ddH2O 8.25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存[6]。
1.2.4 PCR产物的回收纯化与测序 使用H.Q.&.Q凝胶回收试剂盒对PCR扩增后的产物进行回收与纯化[7]。将回收后的产物委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA 测序。将测序结果与GenBank中核酸数据库中的相关序列进行同源性比较。并用neighbor-joining法构建系统发育树。
1.2.5 病原菌生物学特性研究
（1）不同温度对菌丝生长及分生孢子萌发的影响。将菌丝块（d=6 mm）接种于新鲜的PDA平板上，分别放入温度为4、10、15、20、25、30、35、40 ℃的培养箱中，每种处理设置5个重复。培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。培养12 d后，在菌落表面加入15 mL无菌水，用两层纱布过滤后得分生孢子悬浮液，离心后去上清液，用血球计数板将浓度调节至1×106个/mL[8]。取180 μL悬浮液于凹槽玻片中，再分别放置于以上8种温度处理的培养箱中，保湿培养。每个处理设置5个凹槽玻片。15 h后统计分生孢子萌发率（%）[9]。
（2）不同pH对菌丝生长及分生孢子萌发的影响。用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调节PDA培养基pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0[10]（用pH计进行检测）。将菌丝块（d=6 mm）分别接种于以上不同pH值的培养皿中。每种处理设置5个重复。培养5 d后，分别测量菌落直径。分生孢子悬浮液制备方法同1.2.1，用血球计数板调节悬浮液的浓度至1×106个/mL。用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl将分生孢子悬浮液pH值调节至3.0～11.0。分别取180 μL孢子悬浮液滴入凹槽玻片内，每种处理设置5个玻片。在28℃条件下连续培养15 h后分别统计分生孢子的萌发率（%）。
（3）不同光照对菌丝生长及分生孢子萌发的影响。将菌丝块（d=6 mm）接种于PDA平板中。将接种后的平板分别放入连续光照、连续黑暗、12 h光暗交替的人工气候培养箱中，每种处理设置5皿。在28 ℃条件下连续培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。分生孢子悬浮液制备方法同1.2.1，将分生孢子悬浮液浓度调至1×106个/mL。分别取180 μL配好的孢子悬浮液滴入凹槽玻片内，将其放入连续光照、连续黑暗、1 h光暗交替的培养箱内，在28 ℃条件下连续培养15 h后统计分生孢子的萌发率（%）。每种条件处理5次重复。
（4）不同碳源对菌丝生长及分生孢子萌发的影响。不同碳源设为：半乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、果糖、乳糖、可溶性淀粉、阿拉伯糖，以不加任何碳源作为对照（CK），将菌丝块（d=6 mm）接种于以上含有不同碳源的PDA培养基中。每种处理设置5皿。在28 ℃条件下连续培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。分生孢子悬浮液制备方法同1.2.1。分别称取半乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、果糖、乳糖、可溶性淀粉、阿拉伯糖配制成1%的溶液，分别加入孢子悬浮液。再将分生孢子悬浮液浓度调至1×106个/mL。分别取180 μL配好的孢子悬浮液滴入凹槽玻片内，在28 ℃条件下连续培养15 h后统计分生孢子的萌发率（%）。
（5）不同氮源对菌丝生长及产孢量的影响。使用查比克培养基，以不加任何氮源的查比克培养基为对照，用等质量氮元素的蛋白胨、酵母膏浸粉、尿素、甘氨酸、硫酸铵、天冬氨酸、氯化铵代替其中的硝酸钾，配成含有不同氮源的液体培养基。在各个不同氮源的100 mL培养液中各接入2块菌丝块（d=6 mm），每种做5个重复。在25 ℃、120 r/min恒温摇床条件下震荡培养。5 d后过滤出菌丝，置于烘箱中烘至衡重，用电子天平称量菌丝干重（电子天平精度精确到0.000 1 g）。用血球计数板测量菌株在不同碳源滤液中的分生孢子浓度。8 d后测量产孢量。
1.3 数据统计分析
使用SPSS软件分析温度、pH值、光照条件以及不同碳源、氮源对病原菌菌丝生长以及分生孢子萌发的影响。用最小显著差数法（LSD）比较不同条件下的差异显著性（p=0.05）[11]。同时用Excel针对SPSS软件方差分析的结果作图。并标注出正负偏差。
2 结果与分析
2.1 檀香炭疽病林间症状
檀香炭疽病多发于土壤瘠薄，排水不良，湿度过大及植株长势衰弱的林地。在8月上旬～11月上旬为该病高发期。感病初期叶片边缘或中心出现浅褐色的病斑，随着病斑不断扩大，病斑处呈灰褐色，且长满黑色的小点，为病原菌的分生孢子盘，病健交界处呈深紫褐色。最后病斑处穿孔。病斑多半从叶片尖端和边缘开始，逐渐扩大，呈圆形、半圆形或呈不规则状（图1）。 2.2 病原菌形态特征及培养性状观察
该菌菌落在PDA上呈圆形，边缘整齐。菌丝最初为白色，菌落中心逐渐变成浅灰色至深灰色，外缘有一圈白色菌丝，菌落背面最后变成墨绿色，菌丝有隔膜大多在基部分支。培养8 d后，菌落上产生浅橘红色的分生孢子团。分生孢子直、圆柱状、两端钝圆、单胞、无色[12]，大小为10～20 μm×3.5～6.0 μm（图2）。分生孢子附着胞褐色、为近圆形、矩圆形和不规则形。其形态特征与培养性状与刘威[13]对茶树炭疽菌（C. fructicola）的研究结果相似。记录为SA-2。
2.3 致病性测定
将供试菌株接种到健康的檀香植株上，3 d后接种部位开始产生浅褐色的病斑，接种5 d后病斑进一步扩大，且病健交界处呈深紫褐色，病斑处出现破损，接种8 d后病健交界处紫色加深，病斑处叶片扭曲。且发病症状与林间的发病症状相同。对照组没有发病。根据科赫氏法则，将接种后的病叶采回实验室进行分离鉴定，发现与接种所用的菌株一致，则证明接种所用菌株即为SA-2（C. fructicola）（图3）。
2.4 病原菌DNA的提取及rDNA-ITS的扩增结果
提取病原菌DNA后，使用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增，可以扩增出约530 bp的DNA片段，经切胶回收纯化后，测序结果表明其rDNA-ITS基因序列长度为527 bp，将其与NCBI中GenBank里其他的序列进行同源性比较，发现该病原菌与C. fructicola（登录号为KC702988.1）同源性最高，为99%，同时构建系统发育树如图4，结合对该菌的形态学鉴定，进一步从分子水平上鉴定该菌为C. fructicola。
2.5 檀香炭疽病原菌C. fructicola生物学特性研究
2.5.1 不同温度对菌丝生长及分生孢子萌发的影响
研究结果表明（图5-A），在不同的温度条件下，C. fructicola菌落直径存在显著性差异。该病原菌在4、40 ℃时明显受到抑制，均不能生长。在10～35 ℃范围内均适合该菌生长，且30 ℃为该菌的最适生长温度。菌落直径达6.85 cm。其次为25 ℃，菌落直径达6.45 cm。
图5-B结果表明，C. fructicola分生孢子在10～35 ℃范围内均能萌发，且具有显著性差异。其最适萌发温度为30 ℃，萌发率高达84.5%，其次是25、20 ℃，萌发率达74.3%、58.2%，其余温度下，孢子萌发率均不足50%。
2.5.2 不同pH对菌丝生长及分生孢子萌发的影响
图6-A结果表明，在不同pH值条件下，C.fructicola菌丝生长具有显著性差异，pH3.0时，培养基不能凝固，因此不做菌落直径测量。菌丝在pH4.0～11.0条件下均能生长，该病原菌的最适生长pH值为6.0，菌落直径达6.92 cm。其次是pH值为5.0、7.0，菌落直径分别为6.50、6.45 cm，之间不存在显著性差异。pH值设为11.0时，菌丝生长受到明显的抑制，菌落直径仅达5.35 cm。由此可知该菌适宜在偏酸性环境下生长。
图6-B结果表明，C. fructicola在pH4.0～11.0范围内均能萌发，在pH=5.0时萌发率高达94.7%，其次是pH=6.0、7.0，分生孢子萌发率达85.7%、65.7%，其余pH值条件下，分生孢子萌发率均低于60%，在pH11.0时，分生孢子萌发率受到明显的抑制，只达25.5%，由此可知C. fructicola适宜生长在偏酸性环境中。
2.5.3 不同光照对菌丝生长及分生孢子萌发的影响
图7-A结果表明，C. fructicola在连续光照条件下和连续黑暗条件下菌丝生长存在显著性差异，该病原菌最适宜在连续光照条件下生长，菌落直径达6.38 cm，黑暗条件和12 h光暗交替分别为6.17、6.15 cm，无显著性差异。由此可知，连续光照条件更适宜菌丝生长。
图7-B结果表明，黑暗条件最适宜C. fructicola分生孢子的萌发，萌发率高达96.4%。连续黑暗条件与连续光照条件分生孢子萌发率存在显著性差异。光照条件和12 h光暗交替条件下，分生孢子萌发率分别达73.5%、71.5%，无显著性差异。由此可知，连续黑暗更适宜分生孢子的萌发。
2.5.4 不同碳源对菌丝生长及分生孢子萌发的影响 由图8-A结果可知，不同的碳源条件下该病原菌均能生长，但存在着显著性差异。该病原菌在蔗糖为碳源条件下，菌丝生长最快，第5天时达到7.91 cm；其次为可溶性淀粉、果糖、葡萄糖，菌落直径分别为7.17、6.86、6.74 cm。该病原菌对阿拉伯糖的利用率最低，菌落直径仅为5.33 cm，在对照组（未加入任何碳源）中，菌丝也能生长，但菌落直径仅有3.19 cm。
由图8-B结果可知，不同的碳源条件下该病原菌的分生孢子均能萌发，但存在着显著性差异。在蔗糖为碳源条件下，孢子萌发率最高，达到88%；其次为果糖、可溶性淀粉、葡萄糖，萌发率分别为84.7%、84.1%、78.5%。乳糖和阿拉伯糖最不利于该病原菌产生分生孢子。
2.5.5 不同氮源对菌丝生长及产孢量的影响 图9-A结果表明，该病原菌在不同的氮源条件下均能生长，具有显著性差异。在不加任何氮源的查比克培养液中也能生长，但是长势较差。由图9可知该病原菌对蛋白胨的利用率较高，以蛋白胨为氮源的培养液中菌丝干重高达1.06 g，其次为酵母膏浸粉和硫酸铵为氮源时，该病原菌菌丝干重分别为0.89、0.92 g。该病原菌对甘氨酸的利用率最低，菌丝干重为0.78 g。
图9-B结果表明，该病原菌在以下7种不同氮源条件下均能产孢，但产孢量具有显著性差异。以尿素为氮源的培养液更适于产孢，分生孢子浓度高达10.47×106个/mL，其次是以酵母膏浸粉和蛋白胨为氮源时，分生孢子浓度分别为10.06×106个/mL、9.43×106个/mL。在以天冬氨酸为氮源时，其产孢量最少，孢子浓度为4.50×106个/mL。但均高于无氮源条件下的产孢量。 3 讨论与结论
Sutton[14-15]在von Arx[16]炭疽属分类系统的基础上对其划分依据做了修正，Sutton分类系统对炭疽属的划分依据是通过对纯培养物的形态学、培养学和寄主范围的研究来确定，尤其是依据分生孢子和分生孢子附着胞的特征来确定。但是真菌的某些形态特征会因环境条件的改变而改变，因而仅靠形态特征来鉴定真菌种类是不准确的[17-18]。因此，笔者依据培养性状、形态学鉴定以及rDNA-ITS序列分析，将引起檀香炭疽病的病原鉴定为C. fructicola。本研究与张艳敏[19]对冬青炭疽菌（C. fructicola）和Prihastuti H[20]对泰国北部咖啡豆炭疽菌（C. fructicola）的研究结果基本一致。但张艳敏在“云南省部分观赏植物叶面病原真菌的多样性调查和系统学研究”一文中提到未在平板上观察到C. fructicola产生分生孢子，且未进行分生孢子附着胞的观察。本研究中笔者在培养8 d的培养基上观察到橘红色的分生孢子，并对分生孢子进行培养产生附着胞后在数码显微镜下拍照。
研究病原菌的生物学特性对檀香炭疽病的早期诊断与防治、病害的预测预报具有着重大的意义。但针对C. fructicola生物学特性的研究国内外还未见系统报道。笔者研究了不同温度、pH值、光照、碳源、氮源对C. fructicola菌丝生长以及分生孢子萌发的影响，结果表明适宜该菌生长的温度范围为10～35 ℃，最适生长温度为30 ℃，这与炭疽病的高发期在8～11月高温高湿条件下相吻合，分生孢子可在10～35 ℃萌发，最适萌发温度为30 ℃；菌丝在pH4.0～11.0条件下均能生长，该病原菌的最适生长pH值为6.0，分生孢子在pH值为4.0～11.0范围内均能萌发，在pH值为5.0时萌发率最高；连续光照条件更适宜菌丝生长，连续黑暗更适宜分生孢子的萌发；在不同的碳源条件下，该菌对蔗糖的利用率最高；在不同氮源条件下，该病原菌在以蛋白胨、酵母膏浸粉、硫酸铵为氮源的培养液中生长时，长势较好，但尿素作为氮源时更利于该病原菌产孢。从对C. fructicola生物学特性室内测定结果可推测，林间温度的变化与檀香炭疽病的流行有十分密切的关系。高温且连续阴雨的气候条件有利于炭疽病的流行蔓延。因此，在高温雨季的病害盛发初期，应加强对病害的预防工作。通过对檀香炭疽病原的生物学特性研究，对今后深入研究和控制该病害具有一定的参考意义。
参考文献
[1] 王凌晖， 林 宁， 杨 梅， 等. 南方地区珍贵树种研究现状及培育途径[J]. 北华大学学报（自然科学版）， 2008， 9（6）： 551-555.
[2] 杨晓玲. 珍稀而又娇贵的檀香树[J]. 云南林业， 2005， 26（1）： 21-22.
[3] Hyde K D， Cai L， Cannon P F， et al. Colletotrichum names in current use[J]. Fungal Diversity， 2009， 39： 147-182.
[4] 王会芳， 曾向萍， 芮 凯， 等. 苦瓜炭疽病病原鉴定及生物学特性初步研究[J]. 中国农学通报， 2012， 28（7）： 141-145.
[5] 杨 蕊， 石明旺， 赵荣艳， 等. 蒜薹炭疽病病原鉴定及其生物学特性研究[J]. 中国农学通报， 2011， 27（4）： 160-164.
[6] 李 河， 周国英， 卢丽俐. 油茶叶枯病原的形态及ITS序列分析鉴定[J]. 福建林学院学报， 2008， 28（1）： 88-91.
[7] 郝 芳. 油茶根腐病原菌及其PCR快速检测技术研究[D]. 湖南： 中南林业科技大学， 2009：1-7.
[8] 龙亚琴. 金刚藤叶斑病病原学、 发生规律及防治技术研究[D]. 武汉： 华中农业大学， 2009： 35-36.
[9] 杨友联. 中国贵州、 云南、 广西炭疽菌真菌多基因分子系统学研究[D]. 武汉： 华中农业大学， 2010： 10-11.
[10] 李 茂， 蒋昌顺. 主要热带作物对炭疽病抗病机制研究进展[J]. 热带农业科技， 2008， 31（1）： 45-48.
[11] 刘 伟. 油茶炭疽病的病原学、发生规律及防治技术研究[D]. 武汉：华中农业大学， 2012： 21-22.
[12] O'Connell R J， Nash C， Bailey J A. Lectin cytochemistry：a new approach to understanding cell differentiation， pathogenesis and taxonomy in Colletotrichum.In： Colletotrichum： Biology Pathology and Control[M]. // Bailey J A， Jeger M J， eds. Wallingford： CAB International， 1998： 67-87.
[13] 刘 威， 叶乃兴， 陈玉森， 等. 茶树炭疽菌Colletotrichum fructicola的鉴定及系统发育分析[J]. 茶叶科学， 2014， 34（1）： 95-104.
[14] Sutton B C. The Coelomycetes[M]. Kew， UK： Commonwealth Mycological Institute， 1980： 523-527.
[15] Sutton B C. The Coelomycetes fungi imperfect with pycnidia， acervuli and stromata[M]. Kew， UK： Commonwealth Mycological Institute， 1980： 525-526.
[16] Von Arx J A .The genera of fungi sporulating in pure culture[M]. J Cramer， 1974： 132-136.
[17] 王晓鸣， 李建义. 陕西省炭疽菌的研究[J]. 菌物学报， 1987， 6（4）： 211-218.
[18] 燕 勇， 李卫平， 高雯洁， 等. rDNA-ITS序列分析在真菌鉴定中的应用[J]. 中国卫生检验杂志， 2008， 18（10）： 158-196.
[19] 张艳敏. 云南省部分观赏植物叶面病原真菌的多样性调查和系统学研究[D]. 北京：中国林业科学研究院， 2012： 29-30.
[20] Prihastuti H， Cai L， Chen H， et al. Characterization of Colletotrichum species associated with coffee berries in northern Thailand[J]. Fungal Diversity， 2009， 39： 89-109.
关键词 檀香；炭疽病；形态学；rDNA-ITS序列；生物学特性
中图分类号 S763.15 文献标识码 A
Abstract Santalum album L. anthracnose occurs much more seriously in some areas of Hainan. The aim of the research was to figure out the species of anthracnose on S. album L.， The pathogen was identified with its morphologic characters， pathogenicity and rDNA-ITS sequence analysis， and the biological characteristics of the pathogen was also studied. The results showed that C. fructicola was the pathogens of S. album L. anthracnose. The mycelium of pathogen could grow normally at 10～35 ℃， but the favorable temperature was 30 ℃. The conidia germinated at 10～35 ℃， but the optimum temperature was 30 ℃. Mycelia could grow normally on PDA of which pH was among 4.0～11.0， but the optimum pH was 6.0. The conidia could germinate at pH4.0～11.0， but the favorable pH was 5.0. Lightness was favorable for mycelial growth， and darkness was optimum for conidial germination. Sucrose carbon and soluble starch was suitable for mycelial growth， Among the tested media of the nitrogen sources， Czapka liquid medium containing peptone， urea nitrate， yeast extract powder or ammonium sulfate was favorable for mycelia growth.
Key words Santalum album L.； Anthracnose； Morphology； rDNA-ITS sequence； Biological characteristics
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.028
珍贵树种资源是全球重要的战略资源，其培育工作涉及到林业可持续发展战略乃至国家的长远利益[1]。檀香（Santalum album Linn.）是檀香科（Santalaceae）檀香属的一种半寄生小乔木，现被列为国家重点保护植物。檀香应用最广泛的为化妆品、梳妆用品、医药用品、芳香疗法用品。檀香还是良好的冷冻剂、收敛剂、退热剂，能用于治疗偏头痛、丹毒、淋病、膀胱炎等。檀香心材中提取的檀香油是配制高级香水、香精不可缺少的原料之一[2]。檀香属共有16个树种、15个变种，都为常绿半寄生的小乔木或灌木，心材都含有芳香性的檀香油。近几年来被广泛地商业性的引种栽培[2]，因此对檀香病害的研究与防治就显得至关重要。
檀香的主要病害有炭疽病、煤污病、苗木立枯病、根腐病、白粉病等。但在整个海南省病虫害调查过程中发现檀香炭疽病是危害檀香幼树生长的主要病害。感病初期叶片边缘或中心出现浅褐色的病斑，周围有浅紫色晕圈，随着病斑不断扩大，病斑处呈深灰褐色，且长满黑色的小点，病健交界处呈紫褐色。最后病斑处穿孔，造成植株提前落叶。关于檀香炭疽病，目前尚未有比较系统的研究，更无有效的林间防治措施。笔者从檀香炭疽病病原入手，在形态学鉴定和分子鉴定的基础上，深入研究了该病病原菌的生物学特性。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株：2013年5月从海南澄迈县国营澄迈林场采集到的檀香炭疽病样本进行常规组织分离和单胞纯化后[3]，得到供试菌株，移入斜面培养基中4 ℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 病原菌形态观察 将采集到的檀香病叶放入人工气候培养箱中，覆上保鲜膜，保湿培养几天后，用单面刀片将病斑处切成极薄的小片，从而制做成徒手切片，在显微镜下观察病原菌的菌丝形态。将供试菌株在新鲜PDA培养基上活化6 d后，用接种针挑取培养基表面菌丝及分生孢子做成临时玻片[4]，观察病原菌的菌丝、分生孢子的形态。 1.2.2 致病性测定 采用菌丝块活体接种。取生长健壮的檀香幼苗，用75%酒精消毒，再用无菌水冲洗2～3次，用打孔器（d=6 mm）打取已经活化好的供试菌株，用灭菌的接种环将菌丝块移至叶片上，使用空白琼脂块作为对照。放入人工气候培养箱中，并套上保鲜袋保湿培养。每株檀香幼苗接种4片叶片，共设5个重复。接种后24 h移去菌饼，连续观察接种叶片发病情况，并将发病部位进行再次分离，观察是否与接种菌一致。
1.2.3 病原菌DNA提取及rDNA-ITS扩增 将病原菌转入新鲜的培养基中，在28 ℃培养箱中活化5 d后，刮取菌丝于离心管中，使用天根快速提取试剂盒提取病原菌的总DNA[5]。采用真菌通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）扩增DNA。PCR反应体系（25 μL）：引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，Taq酶0.25 μL，Mix 12.5 μL，dNTPs 1 μL，ddH2O 8.25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存[6]。
1.2.4 PCR产物的回收纯化与测序 使用H.Q.&.Q凝胶回收试剂盒对PCR扩增后的产物进行回收与纯化[7]。将回收后的产物委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA 测序。将测序结果与GenBank中核酸数据库中的相关序列进行同源性比较。并用neighbor-joining法构建系统发育树。
1.2.5 病原菌生物学特性研究
（1）不同温度对菌丝生长及分生孢子萌发的影响。将菌丝块（d=6 mm）接种于新鲜的PDA平板上，分别放入温度为4、10、15、20、25、30、35、40 ℃的培养箱中，每种处理设置5个重复。培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。培养12 d后，在菌落表面加入15 mL无菌水，用两层纱布过滤后得分生孢子悬浮液，离心后去上清液，用血球计数板将浓度调节至1×106个/mL[8]。取180 μL悬浮液于凹槽玻片中，再分别放置于以上8种温度处理的培养箱中，保湿培养。每个处理设置5个凹槽玻片。15 h后统计分生孢子萌发率（%）[9]。
（2）不同pH对菌丝生长及分生孢子萌发的影响。用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调节PDA培养基pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0[10]（用pH计进行检测）。将菌丝块（d=6 mm）分别接种于以上不同pH值的培养皿中。每种处理设置5个重复。培养5 d后，分别测量菌落直径。分生孢子悬浮液制备方法同1.2.1，用血球计数板调节悬浮液的浓度至1×106个/mL。用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl将分生孢子悬浮液pH值调节至3.0～11.0。分别取180 μL孢子悬浮液滴入凹槽玻片内，每种处理设置5个玻片。在28℃条件下连续培养15 h后分别统计分生孢子的萌发率（%）。
（3）不同光照对菌丝生长及分生孢子萌发的影响。将菌丝块（d=6 mm）接种于PDA平板中。将接种后的平板分别放入连续光照、连续黑暗、12 h光暗交替的人工气候培养箱中，每种处理设置5皿。在28 ℃条件下连续培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。分生孢子悬浮液制备方法同1.2.1，将分生孢子悬浮液浓度调至1×106个/mL。分别取180 μL配好的孢子悬浮液滴入凹槽玻片内，将其放入连续光照、连续黑暗、1 h光暗交替的培养箱内，在28 ℃条件下连续培养15 h后统计分生孢子的萌发率（%）。每种条件处理5次重复。
（4）不同碳源对菌丝生长及分生孢子萌发的影响。不同碳源设为：半乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、果糖、乳糖、可溶性淀粉、阿拉伯糖，以不加任何碳源作为对照（CK），将菌丝块（d=6 mm）接种于以上含有不同碳源的PDA培养基中。每种处理设置5皿。在28 ℃条件下连续培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。分生孢子悬浮液制备方法同1.2.1。分别称取半乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、果糖、乳糖、可溶性淀粉、阿拉伯糖配制成1%的溶液，分别加入孢子悬浮液。再将分生孢子悬浮液浓度调至1×106个/mL。分别取180 μL配好的孢子悬浮液滴入凹槽玻片内，在28 ℃条件下连续培养15 h后统计分生孢子的萌发率（%）。
（5）不同氮源对菌丝生长及产孢量的影响。使用查比克培养基，以不加任何氮源的查比克培养基为对照，用等质量氮元素的蛋白胨、酵母膏浸粉、尿素、甘氨酸、硫酸铵、天冬氨酸、氯化铵代替其中的硝酸钾，配成含有不同氮源的液体培养基。在各个不同氮源的100 mL培养液中各接入2块菌丝块（d=6 mm），每种做5个重复。在25 ℃、120 r/min恒温摇床条件下震荡培养。5 d后过滤出菌丝，置于烘箱中烘至衡重，用电子天平称量菌丝干重（电子天平精度精确到0.000 1 g）。用血球计数板测量菌株在不同碳源滤液中的分生孢子浓度。8 d后测量产孢量。
1.3 数据统计分析
使用SPSS软件分析温度、pH值、光照条件以及不同碳源、氮源对病原菌菌丝生长以及分生孢子萌发的影响。用最小显著差数法（LSD）比较不同条件下的差异显著性（p=0.05）[11]。同时用Excel针对SPSS软件方差分析的结果作图。并标注出正负偏差。
2 结果与分析
2.1 檀香炭疽病林间症状
檀香炭疽病多发于土壤瘠薄，排水不良，湿度过大及植株长势衰弱的林地。在8月上旬～11月上旬为该病高发期。感病初期叶片边缘或中心出现浅褐色的病斑，随着病斑不断扩大，病斑处呈灰褐色，且长满黑色的小点，为病原菌的分生孢子盘，病健交界处呈深紫褐色。最后病斑处穿孔。病斑多半从叶片尖端和边缘开始，逐渐扩大，呈圆形、半圆形或呈不规则状（图1）。 2.2 病原菌形态特征及培养性状观察
该菌菌落在PDA上呈圆形，边缘整齐。菌丝最初为白色，菌落中心逐渐变成浅灰色至深灰色，外缘有一圈白色菌丝，菌落背面最后变成墨绿色，菌丝有隔膜大多在基部分支。培养8 d后，菌落上产生浅橘红色的分生孢子团。分生孢子直、圆柱状、两端钝圆、单胞、无色[12]，大小为10～20 μm×3.5～6.0 μm（图2）。分生孢子附着胞褐色、为近圆形、矩圆形和不规则形。其形态特征与培养性状与刘威[13]对茶树炭疽菌（C. fructicola）的研究结果相似。记录为SA-2。
2.3 致病性测定
将供试菌株接种到健康的檀香植株上，3 d后接种部位开始产生浅褐色的病斑，接种5 d后病斑进一步扩大，且病健交界处呈深紫褐色，病斑处出现破损，接种8 d后病健交界处紫色加深，病斑处叶片扭曲。且发病症状与林间的发病症状相同。对照组没有发病。根据科赫氏法则，将接种后的病叶采回实验室进行分离鉴定，发现与接种所用的菌株一致，则证明接种所用菌株即为SA-2（C. fructicola）（图3）。
2.4 病原菌DNA的提取及rDNA-ITS的扩增结果
提取病原菌DNA后，使用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增，可以扩增出约530 bp的DNA片段，经切胶回收纯化后，测序结果表明其rDNA-ITS基因序列长度为527 bp，将其与NCBI中GenBank里其他的序列进行同源性比较，发现该病原菌与C. fructicola（登录号为KC702988.1）同源性最高，为99%，同时构建系统发育树如图4，结合对该菌的形态学鉴定，进一步从分子水平上鉴定该菌为C. fructicola。
2.5 檀香炭疽病原菌C. fructicola生物学特性研究
2.5.1 不同温度对菌丝生长及分生孢子萌发的影响
研究结果表明（图5-A），在不同的温度条件下，C. fructicola菌落直径存在显著性差异。该病原菌在4、40 ℃时明显受到抑制，均不能生长。在10～35 ℃范围内均适合该菌生长，且30 ℃为该菌的最适生长温度。菌落直径达6.85 cm。其次为25 ℃，菌落直径达6.45 cm。
图5-B结果表明，C. fructicola分生孢子在10～35 ℃范围内均能萌发，且具有显著性差异。其最适萌发温度为30 ℃，萌发率高达84.5%，其次是25、20 ℃，萌发率达74.3%、58.2%，其余温度下，孢子萌发率均不足50%。
2.5.2 不同pH对菌丝生长及分生孢子萌发的影响
图6-A结果表明，在不同pH值条件下，C.fructicola菌丝生长具有显著性差异，pH3.0时，培养基不能凝固，因此不做菌落直径测量。菌丝在pH4.0～11.0条件下均能生长，该病原菌的最适生长pH值为6.0，菌落直径达6.92 cm。其次是pH值为5.0、7.0，菌落直径分别为6.50、6.45 cm，之间不存在显著性差异。pH值设为11.0时，菌丝生长受到明显的抑制，菌落直径仅达5.35 cm。由此可知该菌适宜在偏酸性环境下生长。
图6-B结果表明，C. fructicola在pH4.0～11.0范围内均能萌发，在pH=5.0时萌发率高达94.7%，其次是pH=6.0、7.0，分生孢子萌发率达85.7%、65.7%，其余pH值条件下，分生孢子萌发率均低于60%，在pH11.0时，分生孢子萌发率受到明显的抑制，只达25.5%，由此可知C. fructicola适宜生长在偏酸性环境中。
2.5.3 不同光照对菌丝生长及分生孢子萌发的影响
图7-A结果表明，C. fructicola在连续光照条件下和连续黑暗条件下菌丝生长存在显著性差异，该病原菌最适宜在连续光照条件下生长，菌落直径达6.38 cm，黑暗条件和12 h光暗交替分别为6.17、6.15 cm，无显著性差异。由此可知，连续光照条件更适宜菌丝生长。
图7-B结果表明，黑暗条件最适宜C. fructicola分生孢子的萌发，萌发率高达96.4%。连续黑暗条件与连续光照条件分生孢子萌发率存在显著性差异。光照条件和12 h光暗交替条件下，分生孢子萌发率分别达73.5%、71.5%，无显著性差异。由此可知，连续黑暗更适宜分生孢子的萌发。
2.5.4 不同碳源对菌丝生长及分生孢子萌发的影响 由图8-A结果可知，不同的碳源条件下该病原菌均能生长，但存在着显著性差异。该病原菌在蔗糖为碳源条件下，菌丝生长最快，第5天时达到7.91 cm；其次为可溶性淀粉、果糖、葡萄糖，菌落直径分别为7.17、6.86、6.74 cm。该病原菌对阿拉伯糖的利用率最低，菌落直径仅为5.33 cm，在对照组（未加入任何碳源）中，菌丝也能生长，但菌落直径仅有3.19 cm。
由图8-B结果可知，不同的碳源条件下该病原菌的分生孢子均能萌发，但存在着显著性差异。在蔗糖为碳源条件下，孢子萌发率最高，达到88%；其次为果糖、可溶性淀粉、葡萄糖，萌发率分别为84.7%、84.1%、78.5%。乳糖和阿拉伯糖最不利于该病原菌产生分生孢子。
2.5.5 不同氮源对菌丝生长及产孢量的影响 图9-A结果表明，该病原菌在不同的氮源条件下均能生长，具有显著性差异。在不加任何氮源的查比克培养液中也能生长，但是长势较差。由图9可知该病原菌对蛋白胨的利用率较高，以蛋白胨为氮源的培养液中菌丝干重高达1.06 g，其次为酵母膏浸粉和硫酸铵为氮源时，该病原菌菌丝干重分别为0.89、0.92 g。该病原菌对甘氨酸的利用率最低，菌丝干重为0.78 g。
图9-B结果表明，该病原菌在以下7种不同氮源条件下均能产孢，但产孢量具有显著性差异。以尿素为氮源的培养液更适于产孢，分生孢子浓度高达10.47×106个/mL，其次是以酵母膏浸粉和蛋白胨为氮源时，分生孢子浓度分别为10.06×106个/mL、9.43×106个/mL。在以天冬氨酸为氮源时，其产孢量最少，孢子浓度为4.50×106个/mL。但均高于无氮源条件下的产孢量。 3 讨论与结论
Sutton[14-15]在von Arx[16]炭疽属分类系统的基础上对其划分依据做了修正，Sutton分类系统对炭疽属的划分依据是通过对纯培养物的形态学、培养学和寄主范围的研究来确定，尤其是依据分生孢子和分生孢子附着胞的特征来确定。但是真菌的某些形态特征会因环境条件的改变而改变，因而仅靠形态特征来鉴定真菌种类是不准确的[17-18]。因此，笔者依据培养性状、形态学鉴定以及rDNA-ITS序列分析，将引起檀香炭疽病的病原鉴定为C. fructicola。本研究与张艳敏[19]对冬青炭疽菌（C. fructicola）和Prihastuti H[20]对泰国北部咖啡豆炭疽菌（C. fructicola）的研究结果基本一致。但张艳敏在“云南省部分观赏植物叶面病原真菌的多样性调查和系统学研究”一文中提到未在平板上观察到C. fructicola产生分生孢子，且未进行分生孢子附着胞的观察。本研究中笔者在培养8 d的培养基上观察到橘红色的分生孢子，并对分生孢子进行培养产生附着胞后在数码显微镜下拍照。
研究病原菌的生物学特性对檀香炭疽病的早期诊断与防治、病害的预测预报具有着重大的意义。但针对C. fructicola生物学特性的研究国内外还未见系统报道。笔者研究了不同温度、pH值、光照、碳源、氮源对C. fructicola菌丝生长以及分生孢子萌发的影响，结果表明适宜该菌生长的温度范围为10～35 ℃，最适生长温度为30 ℃，这与炭疽病的高发期在8～11月高温高湿条件下相吻合，分生孢子可在10～35 ℃萌发，最适萌发温度为30 ℃；菌丝在pH4.0～11.0条件下均能生长，该病原菌的最适生长pH值为6.0，分生孢子在pH值为4.0～11.0范围内均能萌发，在pH值为5.0时萌发率最高；连续光照条件更适宜菌丝生长，连续黑暗更适宜分生孢子的萌发；在不同的碳源条件下，该菌对蔗糖的利用率最高；在不同氮源条件下，该病原菌在以蛋白胨、酵母膏浸粉、硫酸铵为氮源的培养液中生长时，长势较好，但尿素作为氮源时更利于该病原菌产孢。从对C. fructicola生物学特性室内测定结果可推测，林间温度的变化与檀香炭疽病的流行有十分密切的关系。高温且连续阴雨的气候条件有利于炭疽病的流行蔓延。因此，在高温雨季的病害盛发初期，应加强对病害的预防工作。通过对檀香炭疽病原的生物学特性研究，对今后深入研究和控制该病害具有一定的参考意义。
参考文献
[1] 王凌晖， 林 宁， 杨 梅， 等. 南方地区珍贵树种研究现状及培育途径[J]. 北华大学学报（自然科学版）， 2008， 9（6）： 551-555.
[2] 杨晓玲. 珍稀而又娇贵的檀香树[J]. 云南林业， 2005， 26（1）： 21-22.
[3] Hyde K D， Cai L， Cannon P F， et al. Colletotrichum names in current use[J]. Fungal Diversity， 2009， 39： 147-182.
[4] 王会芳， 曾向萍， 芮 凯， 等. 苦瓜炭疽病病原鉴定及生物学特性初步研究[J]. 中国农学通报， 2012， 28（7）： 141-145.
[5] 杨 蕊， 石明旺， 赵荣艳， 等. 蒜薹炭疽病病原鉴定及其生物学特性研究[J]. 中国农学通报， 2011， 27（4）： 160-164.
[6] 李 河， 周国英， 卢丽俐. 油茶叶枯病原的形态及ITS序列分析鉴定[J]. 福建林学院学报， 2008， 28（1）： 88-91.
[7] 郝 芳. 油茶根腐病原菌及其PCR快速检测技术研究[D]. 湖南： 中南林业科技大学， 2009：1-7.
[8] 龙亚琴. 金刚藤叶斑病病原学、 发生规律及防治技术研究[D]. 武汉： 华中农业大学， 2009： 35-36.
[9] 杨友联. 中国贵州、 云南、 广西炭疽菌真菌多基因分子系统学研究[D]. 武汉： 华中农业大学， 2010： 10-11.
[10] 李 茂， 蒋昌顺. 主要热带作物对炭疽病抗病机制研究进展[J]. 热带农业科技， 2008， 31（1）： 45-48.
[11] 刘 伟. 油茶炭疽病的病原学、发生规律及防治技术研究[D]. 武汉：华中农业大学， 2012： 21-22.
[12] O'Connell R J， Nash C， Bailey J A. Lectin cytochemistry：a new approach to understanding cell differentiation， pathogenesis and taxonomy in Colletotrichum.In： Colletotrichum： Biology Pathology and Control[M]. // Bailey J A， Jeger M J， eds. Wallingford： CAB International， 1998： 67-87.
[13] 刘 威， 叶乃兴， 陈玉森， 等. 茶树炭疽菌Colletotrichum fructicola的鉴定及系统发育分析[J]. 茶叶科学， 2014， 34（1）： 95-104.
[14] Sutton B C. The Coelomycetes[M]. Kew， UK： Commonwealth Mycological Institute， 1980： 523-527.
[15] Sutton B C. The Coelomycetes fungi imperfect with pycnidia， acervuli and stromata[M]. Kew， UK： Commonwealth Mycological Institute， 1980： 525-526.
[16] Von Arx J A .The genera of fungi sporulating in pure culture[M]. J Cramer， 1974： 132-136.
[17] 王晓鸣， 李建义. 陕西省炭疽菌的研究[J]. 菌物学报， 1987， 6（4）： 211-218.
[18] 燕 勇， 李卫平， 高雯洁， 等. rDNA-ITS序列分析在真菌鉴定中的应用[J]. 中国卫生检验杂志， 2008， 18（10）： 158-196.
[19] 张艳敏. 云南省部分观赏植物叶面病原真菌的多样性调查和系统学研究[D]. 北京：中国林业科学研究院， 2012： 29-30.
[20] Prihastuti H， Cai L， Chen H， et al. Characterization of Colletotrichum species associated with coffee berries in northern Thailand[J]. Fungal Diversity， 2009， 39： 89-109.