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摘要：目的 探讨黄芩苷和牛磺酸对β-淀粉样蛋白（Aβ1-42）诱导的阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）大鼠保护作用的最佳配伍比例及作用方式。方法 将SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组、阳性药（安理申）组、黄芩苷和牛磺酸不同比例配伍组，除对照组外，采用侧脑室注射Aβ1-42方法建立AD大鼠模型，各给药组给予相应药物灌胃，对照组及模型组给予等量生理盐水，连续给药40 d。采用避暗实验检测大鼠步入潜伏期和错误次数；应用Morris水迷宫实验检测大鼠逃避潜伏期和穿越目标区域次数。同时，使用5 ?mol/L Aβ1-42诱导神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞建立AD细胞模型，使用不同比例黄芩苷和牛磺酸配伍干预AD细胞模型48 h，采用MTT法检测细胞存活率，计算药物半数有效剂量（EC50）及联合指数。结果 黄芩苷和牛磺酸2∶1及1∶1配伍组均能明显改善AD大鼠学习和记忆能力（P<0.05，P<0.01）。黄芩苷、牛磺酸EC50为2.11、0.422 ?mol/L，联合指数为0.308。结论 黄芩苷和牛磺酸配伍对Aβ1-42诱导的AD大鼠具有协同保护作用，最佳配伍比例为2∶1，EC50为0.279 ?mol/L。
关键词：黄芩苷；牛磺酸；阿尔茨海默病；协同作用；最佳配伍比例；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.10.016
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）10-0054-06
Abstract：Objective To observe the best compatibility proportion and action mode of protective effects of combined baicalin and taurine in Alzheimer’s disease （AD） model. Methods Aβ1-42 was injected through lateral ventricles to establish AD rat models. SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group， aricept group， combined baicalin and taurine in different proportions group. Administration groups were treated with different medicines， while sham-operation group and model group were treated with the same amount of normal saline for 40 days. The step-through latency and the times of mistakes were detected through step-through test；the escape latent and the times of crossing target quadrant were detected through Morris water maze. Furthermore， the human neuroblastoma SH-SY5Y cells were induced by 5 ?mol/L Aβ1-42 for establishing a cellular AD model. The AD cellular model was treated with baicalin and taurine compatibility in different proportions for 48 hours. Then the rate of cell viability was detected byMTT assay， and the median effective concentration （EC50） and combination index were calculated. Results Baicalin and taurine in 2∶1 and 1∶1 proportion groups can significantly improve learning and memory ability in AD rats （P<0.05， P<0.01）. The EC50 were 2.110 ?mol/L and 0.422 ?mol/L， respectively. The combination index was 0.308. Conclusion Baicalin combined with taurine exhibit synergetic protective effects in AD rats induced by Aβ1-42. The optimal compatibility proportion of baicalin and taurine is 2∶1， and EC50 is 0.279 ?mol/L.
Key words：baicalin；taurine；Alzheimer's disease；synergistic effect；optimal compatibility proportion；rats
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）又称老年性痴呆，是一种以认知功能减退为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病，其主要病理改变为脑萎缩、β淀粉样蛋白（beta-amyloid protein，Aβ）沉积、神经元内纤维缠结和皮质及海马区神经元及突触丢失[1]。目前，在AD发病众多假说中，最受关注的是Aβ级联假说，认为可溶性Aβ及其寡聚体在AD发病过程中具有重要作用。临床上，目前使用的治疗AD药物大多是针对AD某一病理环节起作用，不良反应大，费用昂贵，而中药在防治AD方面积累了丰富的临床实践经验，具有一定的潜在优势和研发价值[2]。我们前期研究发现，精制清开灵能够改善鹅膏蕈氨酸诱导的痴呆大鼠模型的认知功能[3]。黄芩苷和牛磺酸是精制清开灵的主要有效组分。采用Aβ1-42诱导的AD动物模型及细胞模型具有实验条件可控、易于操作和观察、干扰因素少等特点。本实验以Aβ1-42所致AD大鼠及SH-SY5Y细胞损伤为模型，研究黄芩苷和牛磺酸配伍用药的最佳比例及相互作用方式，为精制清开灵的临床应用提供实验依据。 1 实验材料
1.1 动物
雄性SPF级SD大鼠120只，4月龄，体质量（230±20）g，北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2009-0015。饲养于北京中医药大学东方医院实验中心SPF级动物实验室，温度（22±2）℃，相对湿度（55±5）%，人工光照时间为明暗各12 h。
1.2 药物与细胞株
黄芩苷和牛磺酸，北京金盛博源生物科技有限公司，含量均大于97%；安理申（盐酸多奈哌齐片），卫材（中国）药业有限公司，批号100609A。神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y购于美国典型培养物收藏中心（ATCC），北京中医药大学东方医院实验中心冻存保种。
1.3 主要试剂与仪器
D-MEM/F-12培养基、青链霉素、0.25%Trypsin- EDTA，美国Gibco公司；胎牛血清，德国PAA公司；六氟异丙醇，阿拉丁试剂（中国）有限公司；Aβ1-42，杭州中肽生化有限公司；二甲基亚砜（DMSO），北京索莱宝科技有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT），美国Sigma公司。程控避暗箱SBA-2和Morris水迷宫DMS-3（中国医学科学院药物所），Tc2323型CO2培养箱（美国SHELLAB公司），CLASS100型超净工作台（珠海造鑫企业有限公司），96孔细胞培养板（德国Greiner Bio-One公司），IX71型倒置荧光相差显微镜和BX-60型倒置荧光相差显微镜数码相机（日本Olympus公司），ELX80酶标仪（美国Bio-Tek公司），1/1000A2005型精密电子天平（德国Saitorius公司），5415D型低温高速多功能离心机（德国Eppendorf公司）。
2 实验方法
2.1 分组
SD大鼠随机分为对照组、模型组、阳性药（安理申）组、黄芩苷和牛磺酸5个不同比例配伍组（药物1～5组），每组15只。
2.2 造模
参考文献[4]方法，采用侧脑室注射Aβ1-42方法建立AD大鼠模型。操作步骤：1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，立体定向仪固定头部，分离骨膜暴露头骨，于前囟后1.3 mm、中线右侧各旁开1.3 mm处， 用牙科钻打开颅骨，用微量进样器垂直进针4 mm至侧脑室，将4 μL（2.5 μg/μL）Aβ1-42溶液缓慢注入，注射时间5 min，留针5 min。对照组注射4 μL生理盐水。
2.3 给药
造模后4 d开始灌胃给药，对照组及模型组予等体积生理盐水，阳性药组每日予0.45 mg/kg安理申，药物组总剂量为每日100 mg/kg（见表1），连续40 d。
2.4 避暗实验
大鼠给药结束后，进行避暗实验。大鼠避暗箱分为明暗两室，避暗仪暗室底部不锈钢栅通36 V、50 Hz交流电，先将大鼠放入避暗仪反应箱中适应3 min，然后待其进入暗箱后给予电击刺激3 s，停留10 s后取出，使其形成暗箱与电击之间的关联记忆。正式实验测试开始时，暗室底部不锈钢栅不通电，将大鼠头部背对洞口放入明室，记录大鼠首次进入暗室的时间（避暗潜伏期）和5 min内进入暗室的错误次数，作为行为学评价指标。实验连续进行3 d，第1日上午开始训练，下午测试，次日及第3日上午各测试1次。
2.5 Morris水迷宫实验
大鼠避暗实验结束后，采用Morris水迷宫实验评价其空间学习和记忆能力。首先进行可视平台实验：平台位于目标象限并使其顶部高于水面2 cm，记录大鼠找到平台的逃避潜伏期和总路程。再进行定位巡航实验：目标象限为第Ⅲ象限，平台位于水面下2 cm，实验连续进行5 d，大鼠从除目标象限外的任一点入水，测定大鼠找到平台的逃避潜伏期和搜索距离。第7日为空间探索实验：撤去平台，将大鼠从除目标象限的任一象限入水，测定大鼠穿越目标象限的次数，在目标象限和相对象限的停留时间。反向平台实验：测试3 d，将平台置于目标象限的相对象限，测定大鼠找到平台的时间（逃避潜伏期）和搜索距离。
2.6 细胞培养
SH-SY5Y细胞培养于含10%胎牛血清、105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的D-MEM/F12培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，2～3 d传代1次。
2.7 黄芩苷和牛磺酸无毒剂量范围确定
取对数生长期的SH-SY5Y细胞，调整细胞浓度为2×107/L，每孔200 ?L接种于96孔细胞培养板内，37 ℃培养24 h，待细胞融合率为80%后，换用无血清培养基进行实验。对照组加入无血清培养基，药物干预组则分别加入终浓度为1.25、2.5、5、10、20、40、80 ?mol/L黄芩苷和1.25、2.5、5、10、20、40、80 ?mol/L牛磺酸，每组设5个复孔，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中孵育48 h。采用MTT法检测细胞活力，弃去每孔细胞中的含药培养基，并加入200 μL终浓度为500 mg/L的MTT溶液，置于5%CO2培养箱中，37 ℃继续培养2～3 h。小心吸去培养基后，每孔加入150 μL DMSO溶液使甲臜溶解，震荡5 min，待紫红色结晶颗粒完全溶解后于酶标仪490 nm波长下测量各组光密度（OD值），计算细胞存活率[（实验组OD值-空白组OD值）÷（对照组OD值-空白组OD值）×100%]。
2.8 Aβ1-42诱导的AD细胞模型的建立及药物干预
AD细胞造模时，取对数生长期的SH-SY5Y细胞以2×107/L浓度、每孔200 ?L接种于96孔细胞培养板内，培养24 h。模型组加入终浓度为5 ?mol/L Aβ1-42的无血清细胞培养基，药物干预组分别加入终浓度为0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 ?mol/L的黄芩苷和牛磺酸，每组设5个复孔。药物最佳配比筛选实验采用析因设计，具体分组见表2。根据配比筛选结果，选取药物最佳配比进行下一步联合用药指数实验，药物终浓度分别为0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 ?mol/L，每组设5个复孔，药物作用48 h，MTT比色法测定各孔OD值，计算细胞存活率和药物对Aβ1-42所致的细胞毒性抑制率[（实验组OD值-模型组OD值）÷（对照组OD值-模型组OD值）×100%][5]。 2.9 药物保护作用半数有效剂量及联合指数的计算
参考文献[6-7]，计算药物保护作用半数有效剂量（EC50）值。药物相互作用以联合指数（CI）表示。CI=[（D）1/（D50）1]+[（D）2/（D50）2]，以CI<1、=1及>1分别表示药物的协同、相加及拮抗作用[8]。D代表药物半数有效剂量。
3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，行为学结果采用两因素重复测量方差分析，并用LSD法进行组间多重比较。组间比较采用方差分析，并做齐性检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 黄芩苷和牛磺酸配伍对AD大鼠避暗实验的影响
与对照组比较，模型组大鼠步入潜伏期显著缩短、错误次数显著增多（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和药物4组步入潜伏期显著延长、错误次数显著减少（P<0.05，P<0.01），药物5组错误次数显著减少（P<0.05），其他药物组无显著变化（P>0.05）。结果见表3。
4.2 黄芩苷和牛磺酸配伍对AD大鼠水迷宫可视平台及定位巡航实验的影响
可视平台实验结果显示，各组逃避潜伏期无明显差异（P>0.05）。定位巡航实验结果表明，与对照组比较，模型组大鼠从第3日开始，逃避潜伏期均明显延长（P<0.05）；与模型组比较，阳性药组和药物1、3、4组在第3日，阳性药组和药物2、3、4组在第4日逃避潜伏期均显著缩短（P<0.05，P<0.01）；药物组在第5日逃避潜伏期无显著缩短（P>0.05）。结果见表4。
4.3 黄芩苷和牛磺酸配伍对AD大鼠空间探索及反向平台实验的影响
空间探索实验结果表明，与对照组比较，模型组大鼠穿越目标区域的次数明显减少（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和药物4组大鼠穿越目标区域的次数显著增多（P<0.01）。反向平台实验结果表明，与对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.05）；与模型组比较，阳性药组和药物2、4组逃避潜伏期均显著缩短（P<0.05，P<0.01），而其他药物组逃避潜伏期无明显变化（P>0.05）。结果见表5。
4.4 不同浓度黄芩苷和牛磺酸对SH-SY5Y细胞存活率的影响
在1.25～20 ?mol/L范围内，黄芩苷对SH-SY5Y细胞无毒性作用；而在20～80 ?mol/L范围内，随着黄芩苷浓度的增高，SH-SY5Y细胞的存活率逐渐下降；2.5～80 ?mol/L牛磺酸对SH-SY5Y细胞均无毒性作用，见图1。因此，本实验选用小于40 ?mol/L黄芩苷和80 ?mol/L牛磺酸的药物剂量进行下一步实验。
4.5 Aβ1-42对SH-SY5Y细胞形态及存活率的影响
镜下观察显示，对照组SH-SY5Y细胞形态规则，排列紧密，胞体突起，细长且均匀，细胞透光性较好，轴突生长良好；模型组细胞经5 ?mol/L Aβ1-42诱导48 h后，活细胞数量减少，局部细胞聚集呈团簇样生长，细胞间隙变大，胞体变圆、肿胀、形态不规则，轴突明显缩短甚至消失，细胞透光度降低，见图2。MTT结果显示，SH-SY5Y细胞经2.5、5、10 ?mol/L Aβ1-42作用48 h后，细胞存活率显下降，分别为（64.07±6.13）%、（50.62±4.98）%和（40.79±3.76）%，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。因此，本实验选用5 ?mol/L的Aβ1-42建立AD神经细胞损伤模型，进行下一步药物保护实验。
4.6 黄芩苷和牛磺酸单独用药对AD细胞模型存活率的影响
不同浓度黄芩苷干预后，在2.5～20 ?mol/L范围内，细胞存活率较模型组明显升高（P<0.01），应用概率单位法得拟合直线方程为Y=1.907X+4.381，EC50值为2.11 ?mol/L；牛磺酸在0.31～10 ?mol/L范围内，细胞存活率较模型组明显升高（P<0.01），见图3。应用概率单位法得拟合直线方程为Y=2.06X+5.771，EC50值为0.422 ?mol/L。
4.7 黄芩苷和牛磺酸配伍用药对AD细胞模型存活率的影响
黄芩苷2.5 ?mol/L和牛磺酸1.25 ?mol/L配伍组（第9组）的保护作用最佳，选择该比例（2∶1）进行下一步实验研究，计算该配比EC50值。当黄芩苷和牛磺酸以2∶1配伍用药时，在0.31～2.5 ?mol/L范围内，细胞存活率较模型组明显升高（P<0.01），见图4。应用概率单位法得拟合直线方程为Y=2.072X+6.148，EC50值为0.279 ?mol/L，低于二者单独用药组。CI值为0.308，根据CI<1表示药物间为协同作用的判定标准，表明黄芩苷和牛磺酸以2∶1配伍时，二者为协同保护作用。
5 讨论
黄芩苷是从唇形科植物黄芩中提取的主要成分，具有抗缺血缺氧、抗自由基、抑制细胞凋亡等多种生物活性，对缺氧、缺糖及再灌注损伤的神经细胞有保护作用[9-11]。牛磺酸是一种β型含硫氨基酸，为常用的抗氧化剂之一，以游离形式存在于机体各种组织和细胞内，在海洋动物中的含量尤为丰富[12]。研究表明，牛磺酸是人体内含量最丰富的含磺酸，作为中枢性神经递质调节中枢神经系统，具有广泛的生物学功能，包括清除氧自由基、抑制脂质过氧化、稳定细胞膜、调节细胞钙稳定、维持细胞渗透压等；在心血管系统有抗心律失常、心肌保护和降压等作用[13-14]。二者配伍使用，具有较好的神经营养和神经损伤保护作用。
学习和记忆能力的减退是AD的主要临床症状，对其进行评价是研究AD动物模型及药物疗效的重要指标之一。避暗实验依鼠类的嗜暗习性而设计，属于被动回避性条件反射，因其方法简单、指标便于观察、实验周期短而被广泛应用于动物学习和记忆能力的测试和药物的筛选。结果显示，AD大鼠的步入潜伏期明显缩短，错误次数明显增多，表明其学习和记忆能力明显下降。经过黄芩苷和牛磺酸2∶1及5∶1配伍用药干预40 d后，AD大鼠学习和记忆能力明显改善。Morris水迷宫实验主要用于检测大小鼠的空间学习记忆能力，广泛应用于药物改善认知功能的评价研究中。本实验结果显示，模型组大鼠在定位巡航及反向平台实验中逃避潜伏期明显延长，在空间探索实验中穿越目标区域次数明显较少，表明模型大鼠存在学习和记忆能力的障碍。经黄芩苷和牛磺酸配伍用药干预后，模型大鼠逃避潜伏明显缩短，穿越目标区域次数明显增多，其中以2∶1及1∶2配伍组改善作用明显。 EC50是指造成半数实验个体产生期望效应时所需的药物浓度。在药效研究中，EC50是评价药物生物效应的重要指标。当以药物剂量为横轴、Aβ1-42所致的细胞毒性抑制率为纵轴直接绘制反应曲线，曲线呈长尾S形，而将剂量取对数后，则剂量反应曲线呈对称的S形。此曲线两端变化较平缓，说明在低剂量和高剂量区，即使剂量变化较大也不会引起反应率的大幅度变化。而曲线中段斜率较大，特别在细胞毒性抑制率50%处剂量稍有改变，就会引起反应率的明显变化，表明EC50是一个非常敏感的指标，对鉴别不同药物的效力大小具有较高的敏感性[15]。因此，本实验采用EC50作为药物效果的衡量指标。EC50的估算方法较多，其中以概率单位法应用最为广泛，该方法1934年由毒理学家Bliss提出，又称Bliss法，随着Finney的研究而得到发展与完善，故本实验应用概率单位法进行计算，即在前述曲线变换的基础上，把细胞毒性抑制率转换成概率单位，再以对数剂量作横轴，以死亡概率单位作散点图，使图形呈直线趋势，拟合直线方程进行EC50值的估算。本实验结果显示，黄芩苷和牛磺酸以2∶1配伍时，对AD细胞损伤具有协同保护作用，可明显提高细胞的存活能力，EC50值相对二者单独用药组较小。
综上，本研究采用AD大鼠和细胞模型评价了清开灵有效组分黄芩苷和牛磺酸的保护作用，结果表明二者具有协同保护作用，最佳配伍比例为2∶1。黄芩苷和牛磺酸配伍用药对AD大鼠学习和记忆能力的改善作用可能与其提高受损神经细胞的存活率有关。该研究结果可为清开灵组分配伍及其他传统中药的进一步优化配伍提供科学依据及方法学参考。
参考文献：
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（收稿日期：2015-03-19）
（修回日期：2015-03-27；编辑：华强）
关键词：黄芩苷；牛磺酸；阿尔茨海默病；协同作用；最佳配伍比例；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.10.016
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）10-0054-06
Abstract：Objective To observe the best compatibility proportion and action mode of protective effects of combined baicalin and taurine in Alzheimer’s disease （AD） model. Methods Aβ1-42 was injected through lateral ventricles to establish AD rat models. SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group， aricept group， combined baicalin and taurine in different proportions group. Administration groups were treated with different medicines， while sham-operation group and model group were treated with the same amount of normal saline for 40 days. The step-through latency and the times of mistakes were detected through step-through test；the escape latent and the times of crossing target quadrant were detected through Morris water maze. Furthermore， the human neuroblastoma SH-SY5Y cells were induced by 5 ?mol/L Aβ1-42 for establishing a cellular AD model. The AD cellular model was treated with baicalin and taurine compatibility in different proportions for 48 hours. Then the rate of cell viability was detected byMTT assay， and the median effective concentration （EC50） and combination index were calculated. Results Baicalin and taurine in 2∶1 and 1∶1 proportion groups can significantly improve learning and memory ability in AD rats （P<0.05， P<0.01）. The EC50 were 2.110 ?mol/L and 0.422 ?mol/L， respectively. The combination index was 0.308. Conclusion Baicalin combined with taurine exhibit synergetic protective effects in AD rats induced by Aβ1-42. The optimal compatibility proportion of baicalin and taurine is 2∶1， and EC50 is 0.279 ?mol/L.
Key words：baicalin；taurine；Alzheimer's disease；synergistic effect；optimal compatibility proportion；rats
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）又称老年性痴呆，是一种以认知功能减退为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病，其主要病理改变为脑萎缩、β淀粉样蛋白（beta-amyloid protein，Aβ）沉积、神经元内纤维缠结和皮质及海马区神经元及突触丢失[1]。目前，在AD发病众多假说中，最受关注的是Aβ级联假说，认为可溶性Aβ及其寡聚体在AD发病过程中具有重要作用。临床上，目前使用的治疗AD药物大多是针对AD某一病理环节起作用，不良反应大，费用昂贵，而中药在防治AD方面积累了丰富的临床实践经验，具有一定的潜在优势和研发价值[2]。我们前期研究发现，精制清开灵能够改善鹅膏蕈氨酸诱导的痴呆大鼠模型的认知功能[3]。黄芩苷和牛磺酸是精制清开灵的主要有效组分。采用Aβ1-42诱导的AD动物模型及细胞模型具有实验条件可控、易于操作和观察、干扰因素少等特点。本实验以Aβ1-42所致AD大鼠及SH-SY5Y细胞损伤为模型，研究黄芩苷和牛磺酸配伍用药的最佳比例及相互作用方式，为精制清开灵的临床应用提供实验依据。 1 实验材料
1.1 动物
雄性SPF级SD大鼠120只，4月龄，体质量（230±20）g，北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2009-0015。饲养于北京中医药大学东方医院实验中心SPF级动物实验室，温度（22±2）℃，相对湿度（55±5）%，人工光照时间为明暗各12 h。
1.2 药物与细胞株
黄芩苷和牛磺酸，北京金盛博源生物科技有限公司，含量均大于97%；安理申（盐酸多奈哌齐片），卫材（中国）药业有限公司，批号100609A。神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y购于美国典型培养物收藏中心（ATCC），北京中医药大学东方医院实验中心冻存保种。
1.3 主要试剂与仪器
D-MEM/F-12培养基、青链霉素、0.25%Trypsin- EDTA，美国Gibco公司；胎牛血清，德国PAA公司；六氟异丙醇，阿拉丁试剂（中国）有限公司；Aβ1-42，杭州中肽生化有限公司；二甲基亚砜（DMSO），北京索莱宝科技有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT），美国Sigma公司。程控避暗箱SBA-2和Morris水迷宫DMS-3（中国医学科学院药物所），Tc2323型CO2培养箱（美国SHELLAB公司），CLASS100型超净工作台（珠海造鑫企业有限公司），96孔细胞培养板（德国Greiner Bio-One公司），IX71型倒置荧光相差显微镜和BX-60型倒置荧光相差显微镜数码相机（日本Olympus公司），ELX80酶标仪（美国Bio-Tek公司），1/1000A2005型精密电子天平（德国Saitorius公司），5415D型低温高速多功能离心机（德国Eppendorf公司）。
2 实验方法
2.1 分组
SD大鼠随机分为对照组、模型组、阳性药（安理申）组、黄芩苷和牛磺酸5个不同比例配伍组（药物1～5组），每组15只。
2.2 造模
参考文献[4]方法，采用侧脑室注射Aβ1-42方法建立AD大鼠模型。操作步骤：1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，立体定向仪固定头部，分离骨膜暴露头骨，于前囟后1.3 mm、中线右侧各旁开1.3 mm处， 用牙科钻打开颅骨，用微量进样器垂直进针4 mm至侧脑室，将4 μL（2.5 μg/μL）Aβ1-42溶液缓慢注入，注射时间5 min，留针5 min。对照组注射4 μL生理盐水。
2.3 给药
造模后4 d开始灌胃给药，对照组及模型组予等体积生理盐水，阳性药组每日予0.45 mg/kg安理申，药物组总剂量为每日100 mg/kg（见表1），连续40 d。
2.4 避暗实验
大鼠给药结束后，进行避暗实验。大鼠避暗箱分为明暗两室，避暗仪暗室底部不锈钢栅通36 V、50 Hz交流电，先将大鼠放入避暗仪反应箱中适应3 min，然后待其进入暗箱后给予电击刺激3 s，停留10 s后取出，使其形成暗箱与电击之间的关联记忆。正式实验测试开始时，暗室底部不锈钢栅不通电，将大鼠头部背对洞口放入明室，记录大鼠首次进入暗室的时间（避暗潜伏期）和5 min内进入暗室的错误次数，作为行为学评价指标。实验连续进行3 d，第1日上午开始训练，下午测试，次日及第3日上午各测试1次。
2.5 Morris水迷宫实验
大鼠避暗实验结束后，采用Morris水迷宫实验评价其空间学习和记忆能力。首先进行可视平台实验：平台位于目标象限并使其顶部高于水面2 cm，记录大鼠找到平台的逃避潜伏期和总路程。再进行定位巡航实验：目标象限为第Ⅲ象限，平台位于水面下2 cm，实验连续进行5 d，大鼠从除目标象限外的任一点入水，测定大鼠找到平台的逃避潜伏期和搜索距离。第7日为空间探索实验：撤去平台，将大鼠从除目标象限的任一象限入水，测定大鼠穿越目标象限的次数，在目标象限和相对象限的停留时间。反向平台实验：测试3 d，将平台置于目标象限的相对象限，测定大鼠找到平台的时间（逃避潜伏期）和搜索距离。
2.6 细胞培养
SH-SY5Y细胞培养于含10%胎牛血清、105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的D-MEM/F12培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，2～3 d传代1次。
2.7 黄芩苷和牛磺酸无毒剂量范围确定
取对数生长期的SH-SY5Y细胞，调整细胞浓度为2×107/L，每孔200 ?L接种于96孔细胞培养板内，37 ℃培养24 h，待细胞融合率为80%后，换用无血清培养基进行实验。对照组加入无血清培养基，药物干预组则分别加入终浓度为1.25、2.5、5、10、20、40、80 ?mol/L黄芩苷和1.25、2.5、5、10、20、40、80 ?mol/L牛磺酸，每组设5个复孔，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中孵育48 h。采用MTT法检测细胞活力，弃去每孔细胞中的含药培养基，并加入200 μL终浓度为500 mg/L的MTT溶液，置于5%CO2培养箱中，37 ℃继续培养2～3 h。小心吸去培养基后，每孔加入150 μL DMSO溶液使甲臜溶解，震荡5 min，待紫红色结晶颗粒完全溶解后于酶标仪490 nm波长下测量各组光密度（OD值），计算细胞存活率[（实验组OD值-空白组OD值）÷（对照组OD值-空白组OD值）×100%]。
2.8 Aβ1-42诱导的AD细胞模型的建立及药物干预
AD细胞造模时，取对数生长期的SH-SY5Y细胞以2×107/L浓度、每孔200 ?L接种于96孔细胞培养板内，培养24 h。模型组加入终浓度为5 ?mol/L Aβ1-42的无血清细胞培养基，药物干预组分别加入终浓度为0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 ?mol/L的黄芩苷和牛磺酸，每组设5个复孔。药物最佳配比筛选实验采用析因设计，具体分组见表2。根据配比筛选结果，选取药物最佳配比进行下一步联合用药指数实验，药物终浓度分别为0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 ?mol/L，每组设5个复孔，药物作用48 h，MTT比色法测定各孔OD值，计算细胞存活率和药物对Aβ1-42所致的细胞毒性抑制率[（实验组OD值-模型组OD值）÷（对照组OD值-模型组OD值）×100%][5]。 2.9 药物保护作用半数有效剂量及联合指数的计算
参考文献[6-7]，计算药物保护作用半数有效剂量（EC50）值。药物相互作用以联合指数（CI）表示。CI=[（D）1/（D50）1]+[（D）2/（D50）2]，以CI<1、=1及>1分别表示药物的协同、相加及拮抗作用[8]。D代表药物半数有效剂量。
3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，行为学结果采用两因素重复测量方差分析，并用LSD法进行组间多重比较。组间比较采用方差分析，并做齐性检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 黄芩苷和牛磺酸配伍对AD大鼠避暗实验的影响
与对照组比较，模型组大鼠步入潜伏期显著缩短、错误次数显著增多（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和药物4组步入潜伏期显著延长、错误次数显著减少（P<0.05，P<0.01），药物5组错误次数显著减少（P<0.05），其他药物组无显著变化（P>0.05）。结果见表3。
4.2 黄芩苷和牛磺酸配伍对AD大鼠水迷宫可视平台及定位巡航实验的影响
可视平台实验结果显示，各组逃避潜伏期无明显差异（P>0.05）。定位巡航实验结果表明，与对照组比较，模型组大鼠从第3日开始，逃避潜伏期均明显延长（P<0.05）；与模型组比较，阳性药组和药物1、3、4组在第3日，阳性药组和药物2、3、4组在第4日逃避潜伏期均显著缩短（P<0.05，P<0.01）；药物组在第5日逃避潜伏期无显著缩短（P>0.05）。结果见表4。
4.3 黄芩苷和牛磺酸配伍对AD大鼠空间探索及反向平台实验的影响
空间探索实验结果表明，与对照组比较，模型组大鼠穿越目标区域的次数明显减少（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和药物4组大鼠穿越目标区域的次数显著增多（P<0.01）。反向平台实验结果表明，与对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.05）；与模型组比较，阳性药组和药物2、4组逃避潜伏期均显著缩短（P<0.05，P<0.01），而其他药物组逃避潜伏期无明显变化（P>0.05）。结果见表5。
4.4 不同浓度黄芩苷和牛磺酸对SH-SY5Y细胞存活率的影响
在1.25～20 ?mol/L范围内，黄芩苷对SH-SY5Y细胞无毒性作用；而在20～80 ?mol/L范围内，随着黄芩苷浓度的增高，SH-SY5Y细胞的存活率逐渐下降；2.5～80 ?mol/L牛磺酸对SH-SY5Y细胞均无毒性作用，见图1。因此，本实验选用小于40 ?mol/L黄芩苷和80 ?mol/L牛磺酸的药物剂量进行下一步实验。
4.5 Aβ1-42对SH-SY5Y细胞形态及存活率的影响
镜下观察显示，对照组SH-SY5Y细胞形态规则，排列紧密，胞体突起，细长且均匀，细胞透光性较好，轴突生长良好；模型组细胞经5 ?mol/L Aβ1-42诱导48 h后，活细胞数量减少，局部细胞聚集呈团簇样生长，细胞间隙变大，胞体变圆、肿胀、形态不规则，轴突明显缩短甚至消失，细胞透光度降低，见图2。MTT结果显示，SH-SY5Y细胞经2.5、5、10 ?mol/L Aβ1-42作用48 h后，细胞存活率显下降，分别为（64.07±6.13）%、（50.62±4.98）%和（40.79±3.76）%，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。因此，本实验选用5 ?mol/L的Aβ1-42建立AD神经细胞损伤模型，进行下一步药物保护实验。
4.6 黄芩苷和牛磺酸单独用药对AD细胞模型存活率的影响
不同浓度黄芩苷干预后，在2.5～20 ?mol/L范围内，细胞存活率较模型组明显升高（P<0.01），应用概率单位法得拟合直线方程为Y=1.907X+4.381，EC50值为2.11 ?mol/L；牛磺酸在0.31～10 ?mol/L范围内，细胞存活率较模型组明显升高（P<0.01），见图3。应用概率单位法得拟合直线方程为Y=2.06X+5.771，EC50值为0.422 ?mol/L。
4.7 黄芩苷和牛磺酸配伍用药对AD细胞模型存活率的影响
黄芩苷2.5 ?mol/L和牛磺酸1.25 ?mol/L配伍组（第9组）的保护作用最佳，选择该比例（2∶1）进行下一步实验研究，计算该配比EC50值。当黄芩苷和牛磺酸以2∶1配伍用药时，在0.31～2.5 ?mol/L范围内，细胞存活率较模型组明显升高（P<0.01），见图4。应用概率单位法得拟合直线方程为Y=2.072X+6.148，EC50值为0.279 ?mol/L，低于二者单独用药组。CI值为0.308，根据CI<1表示药物间为协同作用的判定标准，表明黄芩苷和牛磺酸以2∶1配伍时，二者为协同保护作用。
5 讨论
黄芩苷是从唇形科植物黄芩中提取的主要成分，具有抗缺血缺氧、抗自由基、抑制细胞凋亡等多种生物活性，对缺氧、缺糖及再灌注损伤的神经细胞有保护作用[9-11]。牛磺酸是一种β型含硫氨基酸，为常用的抗氧化剂之一，以游离形式存在于机体各种组织和细胞内，在海洋动物中的含量尤为丰富[12]。研究表明，牛磺酸是人体内含量最丰富的含磺酸，作为中枢性神经递质调节中枢神经系统，具有广泛的生物学功能，包括清除氧自由基、抑制脂质过氧化、稳定细胞膜、调节细胞钙稳定、维持细胞渗透压等；在心血管系统有抗心律失常、心肌保护和降压等作用[13-14]。二者配伍使用，具有较好的神经营养和神经损伤保护作用。
学习和记忆能力的减退是AD的主要临床症状，对其进行评价是研究AD动物模型及药物疗效的重要指标之一。避暗实验依鼠类的嗜暗习性而设计，属于被动回避性条件反射，因其方法简单、指标便于观察、实验周期短而被广泛应用于动物学习和记忆能力的测试和药物的筛选。结果显示，AD大鼠的步入潜伏期明显缩短，错误次数明显增多，表明其学习和记忆能力明显下降。经过黄芩苷和牛磺酸2∶1及5∶1配伍用药干预40 d后，AD大鼠学习和记忆能力明显改善。Morris水迷宫实验主要用于检测大小鼠的空间学习记忆能力，广泛应用于药物改善认知功能的评价研究中。本实验结果显示，模型组大鼠在定位巡航及反向平台实验中逃避潜伏期明显延长，在空间探索实验中穿越目标区域次数明显较少，表明模型大鼠存在学习和记忆能力的障碍。经黄芩苷和牛磺酸配伍用药干预后，模型大鼠逃避潜伏明显缩短，穿越目标区域次数明显增多，其中以2∶1及1∶2配伍组改善作用明显。 EC50是指造成半数实验个体产生期望效应时所需的药物浓度。在药效研究中，EC50是评价药物生物效应的重要指标。当以药物剂量为横轴、Aβ1-42所致的细胞毒性抑制率为纵轴直接绘制反应曲线，曲线呈长尾S形，而将剂量取对数后，则剂量反应曲线呈对称的S形。此曲线两端变化较平缓，说明在低剂量和高剂量区，即使剂量变化较大也不会引起反应率的大幅度变化。而曲线中段斜率较大，特别在细胞毒性抑制率50%处剂量稍有改变，就会引起反应率的明显变化，表明EC50是一个非常敏感的指标，对鉴别不同药物的效力大小具有较高的敏感性[15]。因此，本实验采用EC50作为药物效果的衡量指标。EC50的估算方法较多，其中以概率单位法应用最为广泛，该方法1934年由毒理学家Bliss提出，又称Bliss法，随着Finney的研究而得到发展与完善，故本实验应用概率单位法进行计算，即在前述曲线变换的基础上，把细胞毒性抑制率转换成概率单位，再以对数剂量作横轴，以死亡概率单位作散点图，使图形呈直线趋势，拟合直线方程进行EC50值的估算。本实验结果显示，黄芩苷和牛磺酸以2∶1配伍时，对AD细胞损伤具有协同保护作用，可明显提高细胞的存活能力，EC50值相对二者单独用药组较小。
综上，本研究采用AD大鼠和细胞模型评价了清开灵有效组分黄芩苷和牛磺酸的保护作用，结果表明二者具有协同保护作用，最佳配伍比例为2∶1。黄芩苷和牛磺酸配伍用药对AD大鼠学习和记忆能力的改善作用可能与其提高受损神经细胞的存活率有关。该研究结果可为清开灵组分配伍及其他传统中药的进一步优化配伍提供科学依据及方法学参考。
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（收稿日期：2015-03-19）
（修回日期：2015-03-27；编辑：华强）