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摘 要 以黑皮冬瓜“B98K”种质为试材，根据已克隆的植物NBS类抗病基因保守结构域设计简并引物，PCR扩增冬瓜基因组DNA，获得对应区段的DNA片段，回收克隆与测序后，得到19条抗病同源序列（命名为DNB1至DNB19）。利用DNAStar软件进行序列分析及同源性比对发现，这些抗病同源序列长度在249～252 nt之间，其核苷酸序列同源性在48.4%～98.8%之间，氨基酸序列同源性为23.2%～100.0%，推导氨基酸序列具有P-loop（GGVGKTT）、Kinase-2a（VLDDVW）典型的NBS保守结构域。同源进化分析将其全部归为nonTIR-NBS-LRR 类，与推导氨基酸序列多重比较结果一致；该序列与其他作物已克隆抗病基因的氨基酸序列同源性在24.7%～99.0%之间。该组序列已登录Genbank，登录号为KF776401～KF776419。
关键词 冬瓜；NBS；抗病同源序列；同源克隆；序列分析
中图分类号 S642 文献标识码 A
Abstract According to the conserved domains of NBS type disease-resistant genes in most known plants， two degenerate primers were designed and synthesized. Nineteen RGAs named from DNB1 to DNA19 were obtained by PCR amplification of genome DNA from black wax gourd“B98K”variety. Sequences analysis and alignment results indicated that full-length of these RGAs varied from 249nt to 252nt， the deduced amino acids sequences contained typical conserved domains of NBS family， such as P-loop（GGVGKTT）and Kinase-2a（VLDDVW）. The GenBank accession numbers were obtained（from KF776401 to KF776419）. These RGAs showed great homologous differences with the similarity from 48.4% to 98.8% and with genetic divergence from 1.2 to 88.9 in nucleotide sequence level， while the amino acid sequence homology varied from 23.2% to 100.0%. These RGAs were all divided into nonTIR-NBS-LRR group， which was consistent with the multiple-alignment of deduced amino acid sequences. The similarities varied from 24.7% to 99.0% compared with NBS RGAs of other known species.
Key words Ax gourd； NBS； Resistance gene analogs； Homologous clone； Sequence analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.031
冬瓜（Benincasa hispida Cogn.）属葫芦科冬瓜属1年生蔓性植物，原产中国与印度，现广泛分布于亚洲的热带、亚热带和温带地区。在中国已有2 000多年的栽培历史，南北地区均有种植，年播种面积达25万hm2[1]。冬瓜易栽培，产量高，耐贮运，保健药用价值高[2-3]，是夏秋季节的重要蔬菜之一，也是华南地区北运和出口创汇的重要蔬菜品种，对于调节蔬菜淡季、保证蔬菜周年供应起着非常重要的作用[4]。但冬瓜的各种病害成为制约冬瓜生产的重要因素，其中枯萎病、疫病以及病毒病为冬瓜3大主要病害，南方地区高温多雨，发病更加严重和频繁，损失异常严重[5]。本课题组通过多年种质资源引进、收集和创新，拥有近400份不同抗性冬瓜材料，并通过病原菌复合接种获得了2份冬瓜多抗优异材料[5]，利用本课题组的资源优势，开展冬瓜抗病基因挖掘，分离鉴定与冬瓜抗病相关的基因序列，将为冬瓜抗病品种选育提供理论基础和技术支持。
植物抗病反应是一个复杂过程，抗病基因的分离克隆一直是植物分子生物学研究领域的热点之一。自1992年从玉米中克隆首个抗病基因——抗圆斑病基因Hml以来，迄今已从各种植物中分离克隆了70多个抗病基因[6]，但大多数是通过图位克隆与转座子标签技术获得。这些R基因表达产物存在许多高度保守的区域，如核苷酸结合位点（nucleotide binding site， NBS）、富亮氨酸重复（leucine rich repeat， LRR）、丝氨酸-苏氨酸激酶结构（Ser/Thr-kinase， STK）等[7-9]，以此为基础，将抗病基因分为8类，其中NBS类在植物基因组中含量最为丰富，因此根据这些抗病基因的保守序列设计引物，PCR扩增同源序列，成为克隆该类抗病基因的有效途径，目前已在小麦、水稻、大豆和黄瓜等多种作物中广泛应用[10-13]。本研究以黑皮冬瓜“B98K”为试材，同源扩增NBS类抗病基因序列，为进一步克隆冬瓜的功能性抗病基因及分子标记辅助育种提供研究基础，也对进一步研究冬瓜R基因的起源和遗传进化提供借鉴。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 黑皮冬瓜“B98K”种子由广东省农科院蔬菜研究所保存，2012年8月播种于温室营养盘内，待幼苗长至2～3片真叶，采集叶片保存于-70 ℃冰箱备用。
1.1.2 主要试剂与仪器 克隆宿主菌大肠杆菌DH5α由本课题组保存；琼脂糖购自广州威佳生物技术有限公司；ExTaq DNA聚合酶、dNTPs与pMD 19-T载体试剂盒购自广州瑞真生物技术有限公司；DNA回收试剂盒、Amp抗生素和DNA Marker均购自广州鼎国生物技术有限公司；PCR反应在ABI Applied公司GeneAmp system 9700型扩增仪上进行。
1.2 方法
1.2.2 引物设计与合成 参考白菜、芒果及南瓜等[15-17]NBS类抗病基因的保守结构域，设计合成1对简并引物，由广州英骏生物技术公司合成，引物序列如下：
NBS-F：GGYATGGGNGGYMTHGGNAARAC （P-loop，GMGGI/LGKTT），
NBS-R：CCANACATCATCMAGSACAA（Kinase2，L/VVLDDVW/D），其中Y=C/T，N=A/G/C/T，R=A/G，M=A/C，S=C/G，H=A/T/C。
1.2.3 PCR扩增与克隆 以提取的冬瓜总DNA为模板进行PCR扩增，反应体系总体积为25 μL，包括：2.5 μL 10×Exbuffer（含MgCl2）、1 U ExTaq DNA聚合酶、0.2 mmol/L dNTPs、0.4 μmol/L引物和50 ng模板DNA。反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环； 72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测结果，在GeneGeniusBio Imaging System（Bio-Rad）凝胶成像系统下观察和拍照。
1.2.4 PCR产物的纯化、克隆与测序 PCR产物回收纯化后，与pMD 19-T Vector连接，转化至DH5α感受态细胞内，涂布于固体LB（含Amp，X-gal与IPTG）培养基上，37 ℃倒置培养过夜，挑取白斑，利用M13通用引物进行菌落PCR检测，取1 mL阳性克隆菌液送往广州英骏生物技术有限公司测序。
1.2.5 目的片段序列测定及序列同源性分析 利用Bioedit软件分析RGAs序列范围，除去两端载体部分。克隆片段利用NCBI Blast工具进行同源比对搜索，结合GenBank公布的其他物种NBS-LRR类抗病基因蛋白序列，利用DNAstar软件进行序列比对，分析各序列长度、G+C含量、变异位点、同源性及遗传分歧以及系统发育分析。用于参比的已知抗病基因有：烟草N基因（BAD12594）、亚麻M基因（U73916）、番茄Mi-1.1基因（AF039681）、小麦L11基因（AF093641）、番茄I2C-1基因（AF004878）、拟南芥RPS2基因（U14158），其中RPS2、I2C-1和Mi-1.1属于nonTIR-NBS-LRR类的抗病基因，N、M与L11属于TIR-NBS-LRR类抗病基因。
2 结果与分析
2.1 RGAs的克隆与鉴定
利用简并引物NBS-F与NBS-R扩增黑皮冬瓜基因组DNA，扩增得到250 bp左右的明亮特异条带（图1），回收克隆至pMD 19-T载体，挑取21个菌落，对PCR鉴定为阳性的克隆进行测序，合并序列一致的克隆，最后得到19个特异片段，命名为DNB1至DNB19。测序结果表明，这些片段序列长度在249～252 nt之间，其中DNB1序列最长为252 nt，DNB19序列为250 nt，其余均为249 nt。NCBI blastx同源比对分析发现，这19条RGAs均具有NBS-ARC保守结构域，与其他作物R基因均有较高同源性。基酸序列推导发现，DNB1至DNB18都具有连续开放阅读框（ORF），且都包含NBS类R基因特有的氨基酸保守结构域，因此推测这18条RGAs均为冬瓜RGAs。DNB19也具有NBS类R基因的保守结构，也为抗病基因同源序列，但是它在第5位氨基酸残基处提前终止，不具备连续的ORF。将序列提交至GenBank，获得登录号为KF776401-KF776419。利用MegAlign软件同源比对分析发现，这19条RGAs核苷酸序列同源性在48.4%～98.8%之间，遗传分歧为1.2～88.9，其中DNB2与DNB19、DNB11与DNB16之间同源性最高且遗传分歧最低，分别为98.8%与1.2，DNB7与DNB18同源性最低、遗传分歧最高，分别为48.4%与88.9，由此可见，各序列间同源性变化较大，说明冬瓜RGAs中存在丰富的变异位点（图2，表1）。
利用MegAlign软件对18条RGAs的推导氨基酸序列进行比对，发现其氨基酸同源性在23.2%～100.0%之间，遗传分歧为0.0～211.0，其中DNB6与DNB19以及DNB18与DNB19氨基酸同源性最低均为23.2%，遗传分歧最高为211.0，DNB4与DNB8、DNB4与DNB12、DNB4与DNB13、DNB18与DNB6、DNB12与DNB8、DNB13与DNB8、DNB17与DNB11、DNB16与DNB11、DNB13与DNB12等9对基因片段氨基酸序列同源性为100.0%，其相对应的遗传分歧为0.0（表1）。根据构建的核苷酸序列遗传进化树分析，19条RGAs分为2组，其中DNB6与DNB18与其他片段遗传距离最远，为第一组，其余RGAs为第二组，包括3个亚组，DNB4、DNB13、DNB8、DNB12、DNB11、DNB16与DNB17为第一亚组，DNB3、DNB14、DNB5、DNB9为第二亚组，其它片段组成第3亚组（图3）。由此看出，冬瓜NBS类RGAs基因在进化时表现出较大的遗传分歧。 2.2 冬瓜RGAs保守结构域分析
前人研究报道P-loop区域为GMGGI/LGKTT，Kinase-2区域为（L/F）（L/V）VLD（D/N）（V/M）W，Kinase-3区域为GSR（R/V/K）（V/I）L（L/I/V）TTR[18]。18条RGAs序列比对结果表明冬瓜中NBS类RGAs结构域相当保守，也存在典型的P-loop（GMGGI/LGKTT），Kinase-2（L/VVLDDVW）功能域（图4），然而保守结构域中部分单个氨基酸发生突变，DNB6与DNB18 P-loop功能域GMGGI/LGKTT变为GMGGI/LGKTM，DNB2、DNB7与DNB10的P-loop功能域变为GM GGI/LGKTA；DNB6与DNB18的Kinase-2功能域LLVLDDVW变为VLVLDDVW，但骨架没有改变（图4）。氨基酸序列分析表明，本研究获得的18条序列（DNB1～18）是潜在的候选基因片段。
2.3 冬瓜RGAs氨基酸序列同源性分析
通过NCBI Blastp程序及MegAlign软件对RGAs与已知物种的抗病同源序列进行同源比对，19条RGAs的氨基酸序列表现出明显的NB-ARC保守结构域的特征，与其他物种同源性在24.7%～99.0%之间。其中DNB4、DNB12、DNB13、DNB14、DNB17、DNB18 这6个RGAs与丝瓜NBS-LRR抗性蛋白（AFC97118.1）同源性最高，均为99%，DNB10与其同源性最高为95%，而DNB16与其同源性最高为79%；DNB3、DNB5、DNB7、DNB10、DNB15与来源于黄瓜的NBS-p14-24（AAV38978.1）同源性最高，分别为89%、90%、89%、85%与89%，DNB2、DNB5与瓠瓜NBS-LRR抗性蛋白（AEV46102）同源性最高，均为86%；DNB6、DNB19与来源于黄瓜的推测抗性蛋白At4g27190（XP004172809）同源性最高，分别为79%与80%；DNB1与黄瓜推测抗性蛋白RGA2（XP004148115）同源性最高为74%；DNB8与黄瓜推测抗性蛋白RGA3（XP004152292）同源性最高为82%。
将19条冬瓜RGAs与参比R氨基酸序列构建系统进化树，结果见图5。由图5可知，所有RGAs分成2类，L11、M与N与TIR-NBS-LRR聚为一类，另一类包括所有冬瓜RGAs及RPS2、Mi-1.1、I2C-1，归为nonTIR-NBS-LRR类。这与冬瓜RGAs氨基酸序列多重比对结论一致。
3 讨论与结论
目前冬瓜尚未完成全基因组测序，可利用的相关分子标记也较少，因而通过图位克隆或转座子标签技术法获得R基因难度很大。利用已报道的植物R基因保守结构域，设计特异简并引物分离RGAs，成为克隆R基因的有效途径之一。目前尚未有从冬瓜克隆抗病基因的相关报道，本研究根据已克隆的NBS类R基因保守结构域，设计简并引物，从黑皮冬瓜中分离了19条抗病同源序列，均具有该类基因的保守结构域，其中18条序列具有开放阅读框，1条序列不能翻译为完整的氨基酸序列，可能其属于基因组中的非编码区域，同时也说明从植物中分离NBS类同源基因具有很大的随机性；这些序列与已克隆的黄瓜、丝瓜及葫芦的R基因蛋白有较高的同源性，表明这些序列属于RGAs序列，其中可能存在功能性的R基因，另外也表明冬瓜与黄瓜、丝瓜及葫芦作物近缘的亲缘关系。
NBS结构域是最重要的抗病基因保守结构域之一，在植物抗病反应中起着重要作用，但具有NBS结构域的基因不一定就是抗病基因[19]，如RAS（rat sarcoma）族蛋白、ATPase延伸因子、G蛋白以及ATP/GTP结合蛋白都含有NBS位点[20-21]。因此除了NBS结构域，还需其他可能与抗病更直接相关的重要结构域如TIR（toll or interluken-1 receptor）、LRR（1eucine rich repeats）或LZ（1eucine zipper）等[22]。因此，本研究分离得到的18条NBS类RGAs，仅作为具有潜在功能的抗病基因片段，分离鉴定真正具有抗病功能的基因还需更深入研究。
NBS类基因是已知R基因家族中最大的一类基因，以基因簇多拷贝形式与其他R基因序列排列在染色体上[23-24]，使得基因内和基因间错配、重组、重复的频率大大提高，促进无义基因与新R基因的产生。有研究表明，点突变、重组、不等交换和基因转变是R基因进化的主要动力[24-26]。目前从20多种植物中分离到了许多RGAs序列都表现出了很高的变异性[27-33]。冬瓜的19条RGAs核苷酸序列相似性在48.4%～98.8%之间，RGAs之间有912个变异位点，195～202 nt附近变异幅度较高，说明冬瓜NBS类基因存在一个较大的基因家族，这些基因可能是来自同一基因的不同拷贝，且基因变异程度较高。前人研究报道，NBS区域内Kinase-2结构域最后一个氨基酸残基也是区分TIR-NBS- LRR和nonTIR-NBS-LRR类抗病基因的重要特征[17]，TIR-NBS-LRR类抗病基因中Kinase-2基序最后一个残基都为天冬氨酸（D），而在nonTIR-NBS -LRR类抗病基因中都为色氨酸（W），因此本研究获得的冬瓜RGAs均为nonTIR-NBS-LRR类抗性基因，同源进化分析发现冬瓜RGAs与已知的nonTIR-NBS-LRR类基因RPS2、Mi-1.1、I2C-1聚为一类，因此两种分析结果是一致的。冬瓜RGAs保守结构域也存在较多突变，但未影响到整个保守域性质；保守域外的氨基酸序列变异程度较大，序列整体的相似性变化范围较广（23.2%～100.0%），与其他物种的相似性也在24.7%～99.0%之间。这些点突变、插入和缺失可能是引起冬瓜RGAs多样性的原因。上述研究结果为进化趋异假说提供了一些间接证据[34]。 同源克隆分离R类基因也具有自身局限性，如分离基因具有很大的随机性，获得片段有的不能翻译为完整的氨基酸序列，有的含有保守结构域，但与植物的抗性无关。因此可通过用不同碱基组合的简并引物进行PCR反应，或从不同部位时期cDNA分离RGAs，提高获得不同R序列机会。本研究以黑皮冬瓜“B98K”为试材，同源扩增NBS类抗病基因序列，为进一步克隆冬瓜的功能性抗病基因以及分子标记辅助选择育种提供研究基础，也对进一步研究冬瓜R基因的起源和遗传进化提供借鉴。
参考文献
[1] 中国农业科学院蔬菜花卉研究所. 中国蔬菜品种志[M]. 北京： 中国农业科技出版社， 2001.
[2] 尹晴红， 董敏玉. 冬瓜功能食品对肾系疾患的治疗保健作用[J]. 南京农专学报， 2000， 16（4）： 40.
[3] Diez M J， Pico B， Nuez F. Cucurbit genetic resources in Europe[C]. Adana， Turkey， Ad hoc meeting， 2002，
[4] 谢大森， 何晓明， 赫新洲， 等. 冬瓜主要农艺性状的杂种优势初步分析[J]. 上海农业学报， 2003， 19（2）： 35-37.
[5] 谢大森， 柯 剑， 何晓明， 等. 多抗冬瓜材料的获得及其生理变化规律初步研究[J]. 热带作物学报， 2011， 32（9）： 1 665-1 668.
[6] Gurmuk H S， Steven P B. Reductase activity encode by the Hm1 disease resistance gene in maize[J]. Science， 1992， 258（6）： 985-987.
[7] Liu J L， Liu X L， Dai L Y， et al. Recent progress in elucidating the structure， function and evolution of disease resistance genes in plants[J]. Journal of Genetics and Genomics， 2007， 34（9）： 765-776.
[8] Seah S， Sivasithamparam K， Karakousis A， et al. Cloning and characterization of a family of disease resistance gene analogs from wheat and barley[J]. Theoretical Applied Genetics， 1998， 97： 937-945.
[9] Bent A F. Function meets structure in the study of plant disease resistance genes[J]. Plant Cell， 1996， 8： 1 757-1 771.
[10] 王海燕， 杨文香， 刘大群. 小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J]. 中国农业科学， 2006， 39（8）： 1 558-1 564.
[11] 刘继梅， 程在全， 杨明挚， 等. 云南3种野生稻中抗病基因同源序列的克隆及序列分析[J]. 中国农业科学， 2003， 36（3）： 273-280.
[12] 贺超英， 张志永， 陈受宜. 大豆中NBS类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J]. 科学通报， 2001， 12（4）： 1 017-1 021.
[13] 丁国华， 秦智伟， 刘宏宇， 等. 黄瓜NBS类型抗病基因同源序列的克隆与分析[J]. 园艺学报， 2005， 32（4）： 638-642.
[14] Doyle J J， Doyle J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf material[J]. Phytochemical Bulletin， 1987， 19： 11-15.
[15] 王彦华， 侯喜林， 申书兴，等. 不结球白菜抗病基因同源序列的克隆及分析[J]. 中国农业科学， 2006， 39（12） ： 2 621-2 626.
[16] 刘 洋， 姚全胜， 苏俊波， 等. 芒果NBS类抗病基因同源序列克隆与分析[J]. 植物遗传资源学报， 2013， 14（3）： 571-576.
[17] Meyers B C， Dickerman A W， Michelmore R W， et al. Plant disease resistance genes encode members of an ancient and diverse protein family with the nucleotide-binding superfamily[J]. Plant Journal， 1999， 20： 317-332.
[18] Qilin P， Jonathan W， Kobert F. Divergent evolution of plant NBS-LRR resistance gene homologous in dicot and cereal genomes[J]. J Mol Evol， 2000， 50： 203-213.
[19] He C Y， Zhang Z Y， Chen S Y. Cloning and analysis of a disease resistance gene homolog from soybean[J]. Chinese Science Bulletin， 2001， 46（12）： 1 017-1 021. [20] Baker B， Zambryski E， Staskawicz B， et al. Signaling in plant microbe interaction[J]. Science， 1997， 276： 726-733.
[21] Traut T W. The functions and consensus motifs of nine types of peptide segments that form different types of nucleotide-binding sites[J]. European Journal of Biochemistry， 1994， 222： 9-19.
[22] Ellis J， Dodds P， Pryor T. Structure function and evolution of plant disease resistance genes[J]. Curr Opin Plant Biology， 2000， 3： 278-284.
[23] Belkhadir Y， Subramaniam R， Dangl J L. Plant disease resistance protein signaling： NBS-LRR protein and their partners[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2004， 7： 391-399.
[24] Yuksel B， Estill J C， Schulze S R， et al. Organization and evolution of resistance gene analogs in peanut[J]. Molecular Genetic， 2005， 274： 248-263.
[25] Flor H H. Current status of the gene-for-gene concept[J]. Annual Review of Phytopathology， 1971， 9： 275-296.
[26] Keen N T. Gene-for-gene complementarities in plant-pathogen interactions[J]. Annual Review of Genetics， 1990， 24： 447-463.
[27] 王世全， 张德春， 李 平， 等. 水稻中一个NBS-LRR抗病同源基因家族的克隆和分析[J]. 遗传学报， 2005， 32（7）： 704-711.
[28] 黄 萱， 徐子勤， 陈立余， 等. 小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J]. 分子细胞生物学报， 2006， 39（2）： 91-96.
[29] 陈观水， 周以飞， 林 生， 等. 甘薯NBS类抗病基因类似物的分离与序列分析[J]. 热带亚热带植物学报， 2006， 14（5）： 359-365.
[30] 阙友雄， 许莉萍， 林剑伟， 等. 甘蔗NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J]. 作物学报， 2009， 35（4）： 631-639.
[31] Yuksel B， Estill J C， Schulze S R， et al. Organization and evolution of resistance gene analogs in peanut[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2005， 274： 248-263.
[32] 张向明， 韦靖鸾， 张 丹， 等. 野生稻NBS类抗病基因同源序列的分离与序列分析[J]. 植物遗传资源学报， 2010， 11（6）： 741-748.
[33] 张 楠， 王海燕， 刘大群. 小麦NBS类抗病基因同源cDNA序列的克隆与特征分析[J]. 植物遗传资源学报， 2010， 11（5）： 605-610.
[34] Xu Q， Wen X P， Deng X X. Isolation of TIR NBS-LRR resistance gene an analogues and identification of molecular marker linked to a powdery mildew resistance locus in chestnut rose[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2005， 111： 819-830.
关键词 冬瓜；NBS；抗病同源序列；同源克隆；序列分析
中图分类号 S642 文献标识码 A
Abstract According to the conserved domains of NBS type disease-resistant genes in most known plants， two degenerate primers were designed and synthesized. Nineteen RGAs named from DNB1 to DNA19 were obtained by PCR amplification of genome DNA from black wax gourd“B98K”variety. Sequences analysis and alignment results indicated that full-length of these RGAs varied from 249nt to 252nt， the deduced amino acids sequences contained typical conserved domains of NBS family， such as P-loop（GGVGKTT）and Kinase-2a（VLDDVW）. The GenBank accession numbers were obtained（from KF776401 to KF776419）. These RGAs showed great homologous differences with the similarity from 48.4% to 98.8% and with genetic divergence from 1.2 to 88.9 in nucleotide sequence level， while the amino acid sequence homology varied from 23.2% to 100.0%. These RGAs were all divided into nonTIR-NBS-LRR group， which was consistent with the multiple-alignment of deduced amino acid sequences. The similarities varied from 24.7% to 99.0% compared with NBS RGAs of other known species.
Key words Ax gourd； NBS； Resistance gene analogs； Homologous clone； Sequence analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.031
冬瓜（Benincasa hispida Cogn.）属葫芦科冬瓜属1年生蔓性植物，原产中国与印度，现广泛分布于亚洲的热带、亚热带和温带地区。在中国已有2 000多年的栽培历史，南北地区均有种植，年播种面积达25万hm2[1]。冬瓜易栽培，产量高，耐贮运，保健药用价值高[2-3]，是夏秋季节的重要蔬菜之一，也是华南地区北运和出口创汇的重要蔬菜品种，对于调节蔬菜淡季、保证蔬菜周年供应起着非常重要的作用[4]。但冬瓜的各种病害成为制约冬瓜生产的重要因素，其中枯萎病、疫病以及病毒病为冬瓜3大主要病害，南方地区高温多雨，发病更加严重和频繁，损失异常严重[5]。本课题组通过多年种质资源引进、收集和创新，拥有近400份不同抗性冬瓜材料，并通过病原菌复合接种获得了2份冬瓜多抗优异材料[5]，利用本课题组的资源优势，开展冬瓜抗病基因挖掘，分离鉴定与冬瓜抗病相关的基因序列，将为冬瓜抗病品种选育提供理论基础和技术支持。
植物抗病反应是一个复杂过程，抗病基因的分离克隆一直是植物分子生物学研究领域的热点之一。自1992年从玉米中克隆首个抗病基因——抗圆斑病基因Hml以来，迄今已从各种植物中分离克隆了70多个抗病基因[6]，但大多数是通过图位克隆与转座子标签技术获得。这些R基因表达产物存在许多高度保守的区域，如核苷酸结合位点（nucleotide binding site， NBS）、富亮氨酸重复（leucine rich repeat， LRR）、丝氨酸-苏氨酸激酶结构（Ser/Thr-kinase， STK）等[7-9]，以此为基础，将抗病基因分为8类，其中NBS类在植物基因组中含量最为丰富，因此根据这些抗病基因的保守序列设计引物，PCR扩增同源序列，成为克隆该类抗病基因的有效途径，目前已在小麦、水稻、大豆和黄瓜等多种作物中广泛应用[10-13]。本研究以黑皮冬瓜“B98K”为试材，同源扩增NBS类抗病基因序列，为进一步克隆冬瓜的功能性抗病基因及分子标记辅助育种提供研究基础，也对进一步研究冬瓜R基因的起源和遗传进化提供借鉴。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 黑皮冬瓜“B98K”种子由广东省农科院蔬菜研究所保存，2012年8月播种于温室营养盘内，待幼苗长至2～3片真叶，采集叶片保存于-70 ℃冰箱备用。
1.1.2 主要试剂与仪器 克隆宿主菌大肠杆菌DH5α由本课题组保存；琼脂糖购自广州威佳生物技术有限公司；ExTaq DNA聚合酶、dNTPs与pMD 19-T载体试剂盒购自广州瑞真生物技术有限公司；DNA回收试剂盒、Amp抗生素和DNA Marker均购自广州鼎国生物技术有限公司；PCR反应在ABI Applied公司GeneAmp system 9700型扩增仪上进行。
1.2 方法
1.2.2 引物设计与合成 参考白菜、芒果及南瓜等[15-17]NBS类抗病基因的保守结构域，设计合成1对简并引物，由广州英骏生物技术公司合成，引物序列如下：
NBS-F：GGYATGGGNGGYMTHGGNAARAC （P-loop，GMGGI/LGKTT），
NBS-R：CCANACATCATCMAGSACAA（Kinase2，L/VVLDDVW/D），其中Y=C/T，N=A/G/C/T，R=A/G，M=A/C，S=C/G，H=A/T/C。
1.2.3 PCR扩增与克隆 以提取的冬瓜总DNA为模板进行PCR扩增，反应体系总体积为25 μL，包括：2.5 μL 10×Exbuffer（含MgCl2）、1 U ExTaq DNA聚合酶、0.2 mmol/L dNTPs、0.4 μmol/L引物和50 ng模板DNA。反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环； 72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测结果，在GeneGeniusBio Imaging System（Bio-Rad）凝胶成像系统下观察和拍照。
1.2.4 PCR产物的纯化、克隆与测序 PCR产物回收纯化后，与pMD 19-T Vector连接，转化至DH5α感受态细胞内，涂布于固体LB（含Amp，X-gal与IPTG）培养基上，37 ℃倒置培养过夜，挑取白斑，利用M13通用引物进行菌落PCR检测，取1 mL阳性克隆菌液送往广州英骏生物技术有限公司测序。
1.2.5 目的片段序列测定及序列同源性分析 利用Bioedit软件分析RGAs序列范围，除去两端载体部分。克隆片段利用NCBI Blast工具进行同源比对搜索，结合GenBank公布的其他物种NBS-LRR类抗病基因蛋白序列，利用DNAstar软件进行序列比对，分析各序列长度、G+C含量、变异位点、同源性及遗传分歧以及系统发育分析。用于参比的已知抗病基因有：烟草N基因（BAD12594）、亚麻M基因（U73916）、番茄Mi-1.1基因（AF039681）、小麦L11基因（AF093641）、番茄I2C-1基因（AF004878）、拟南芥RPS2基因（U14158），其中RPS2、I2C-1和Mi-1.1属于nonTIR-NBS-LRR类的抗病基因，N、M与L11属于TIR-NBS-LRR类抗病基因。
2 结果与分析
2.1 RGAs的克隆与鉴定
利用简并引物NBS-F与NBS-R扩增黑皮冬瓜基因组DNA，扩增得到250 bp左右的明亮特异条带（图1），回收克隆至pMD 19-T载体，挑取21个菌落，对PCR鉴定为阳性的克隆进行测序，合并序列一致的克隆，最后得到19个特异片段，命名为DNB1至DNB19。测序结果表明，这些片段序列长度在249～252 nt之间，其中DNB1序列最长为252 nt，DNB19序列为250 nt，其余均为249 nt。NCBI blastx同源比对分析发现，这19条RGAs均具有NBS-ARC保守结构域，与其他作物R基因均有较高同源性。基酸序列推导发现，DNB1至DNB18都具有连续开放阅读框（ORF），且都包含NBS类R基因特有的氨基酸保守结构域，因此推测这18条RGAs均为冬瓜RGAs。DNB19也具有NBS类R基因的保守结构，也为抗病基因同源序列，但是它在第5位氨基酸残基处提前终止，不具备连续的ORF。将序列提交至GenBank，获得登录号为KF776401-KF776419。利用MegAlign软件同源比对分析发现，这19条RGAs核苷酸序列同源性在48.4%～98.8%之间，遗传分歧为1.2～88.9，其中DNB2与DNB19、DNB11与DNB16之间同源性最高且遗传分歧最低，分别为98.8%与1.2，DNB7与DNB18同源性最低、遗传分歧最高，分别为48.4%与88.9，由此可见，各序列间同源性变化较大，说明冬瓜RGAs中存在丰富的变异位点（图2，表1）。
利用MegAlign软件对18条RGAs的推导氨基酸序列进行比对，发现其氨基酸同源性在23.2%～100.0%之间，遗传分歧为0.0～211.0，其中DNB6与DNB19以及DNB18与DNB19氨基酸同源性最低均为23.2%，遗传分歧最高为211.0，DNB4与DNB8、DNB4与DNB12、DNB4与DNB13、DNB18与DNB6、DNB12与DNB8、DNB13与DNB8、DNB17与DNB11、DNB16与DNB11、DNB13与DNB12等9对基因片段氨基酸序列同源性为100.0%，其相对应的遗传分歧为0.0（表1）。根据构建的核苷酸序列遗传进化树分析，19条RGAs分为2组，其中DNB6与DNB18与其他片段遗传距离最远，为第一组，其余RGAs为第二组，包括3个亚组，DNB4、DNB13、DNB8、DNB12、DNB11、DNB16与DNB17为第一亚组，DNB3、DNB14、DNB5、DNB9为第二亚组，其它片段组成第3亚组（图3）。由此看出，冬瓜NBS类RGAs基因在进化时表现出较大的遗传分歧。 2.2 冬瓜RGAs保守结构域分析
前人研究报道P-loop区域为GMGGI/LGKTT，Kinase-2区域为（L/F）（L/V）VLD（D/N）（V/M）W，Kinase-3区域为GSR（R/V/K）（V/I）L（L/I/V）TTR[18]。18条RGAs序列比对结果表明冬瓜中NBS类RGAs结构域相当保守，也存在典型的P-loop（GMGGI/LGKTT），Kinase-2（L/VVLDDVW）功能域（图4），然而保守结构域中部分单个氨基酸发生突变，DNB6与DNB18 P-loop功能域GMGGI/LGKTT变为GMGGI/LGKTM，DNB2、DNB7与DNB10的P-loop功能域变为GM GGI/LGKTA；DNB6与DNB18的Kinase-2功能域LLVLDDVW变为VLVLDDVW，但骨架没有改变（图4）。氨基酸序列分析表明，本研究获得的18条序列（DNB1～18）是潜在的候选基因片段。
2.3 冬瓜RGAs氨基酸序列同源性分析
通过NCBI Blastp程序及MegAlign软件对RGAs与已知物种的抗病同源序列进行同源比对，19条RGAs的氨基酸序列表现出明显的NB-ARC保守结构域的特征，与其他物种同源性在24.7%～99.0%之间。其中DNB4、DNB12、DNB13、DNB14、DNB17、DNB18 这6个RGAs与丝瓜NBS-LRR抗性蛋白（AFC97118.1）同源性最高，均为99%，DNB10与其同源性最高为95%，而DNB16与其同源性最高为79%；DNB3、DNB5、DNB7、DNB10、DNB15与来源于黄瓜的NBS-p14-24（AAV38978.1）同源性最高，分别为89%、90%、89%、85%与89%，DNB2、DNB5与瓠瓜NBS-LRR抗性蛋白（AEV46102）同源性最高，均为86%；DNB6、DNB19与来源于黄瓜的推测抗性蛋白At4g27190（XP004172809）同源性最高，分别为79%与80%；DNB1与黄瓜推测抗性蛋白RGA2（XP004148115）同源性最高为74%；DNB8与黄瓜推测抗性蛋白RGA3（XP004152292）同源性最高为82%。
将19条冬瓜RGAs与参比R氨基酸序列构建系统进化树，结果见图5。由图5可知，所有RGAs分成2类，L11、M与N与TIR-NBS-LRR聚为一类，另一类包括所有冬瓜RGAs及RPS2、Mi-1.1、I2C-1，归为nonTIR-NBS-LRR类。这与冬瓜RGAs氨基酸序列多重比对结论一致。
3 讨论与结论
目前冬瓜尚未完成全基因组测序，可利用的相关分子标记也较少，因而通过图位克隆或转座子标签技术法获得R基因难度很大。利用已报道的植物R基因保守结构域，设计特异简并引物分离RGAs，成为克隆R基因的有效途径之一。目前尚未有从冬瓜克隆抗病基因的相关报道，本研究根据已克隆的NBS类R基因保守结构域，设计简并引物，从黑皮冬瓜中分离了19条抗病同源序列，均具有该类基因的保守结构域，其中18条序列具有开放阅读框，1条序列不能翻译为完整的氨基酸序列，可能其属于基因组中的非编码区域，同时也说明从植物中分离NBS类同源基因具有很大的随机性；这些序列与已克隆的黄瓜、丝瓜及葫芦的R基因蛋白有较高的同源性，表明这些序列属于RGAs序列，其中可能存在功能性的R基因，另外也表明冬瓜与黄瓜、丝瓜及葫芦作物近缘的亲缘关系。
NBS结构域是最重要的抗病基因保守结构域之一，在植物抗病反应中起着重要作用，但具有NBS结构域的基因不一定就是抗病基因[19]，如RAS（rat sarcoma）族蛋白、ATPase延伸因子、G蛋白以及ATP/GTP结合蛋白都含有NBS位点[20-21]。因此除了NBS结构域，还需其他可能与抗病更直接相关的重要结构域如TIR（toll or interluken-1 receptor）、LRR（1eucine rich repeats）或LZ（1eucine zipper）等[22]。因此，本研究分离得到的18条NBS类RGAs，仅作为具有潜在功能的抗病基因片段，分离鉴定真正具有抗病功能的基因还需更深入研究。
NBS类基因是已知R基因家族中最大的一类基因，以基因簇多拷贝形式与其他R基因序列排列在染色体上[23-24]，使得基因内和基因间错配、重组、重复的频率大大提高，促进无义基因与新R基因的产生。有研究表明，点突变、重组、不等交换和基因转变是R基因进化的主要动力[24-26]。目前从20多种植物中分离到了许多RGAs序列都表现出了很高的变异性[27-33]。冬瓜的19条RGAs核苷酸序列相似性在48.4%～98.8%之间，RGAs之间有912个变异位点，195～202 nt附近变异幅度较高，说明冬瓜NBS类基因存在一个较大的基因家族，这些基因可能是来自同一基因的不同拷贝，且基因变异程度较高。前人研究报道，NBS区域内Kinase-2结构域最后一个氨基酸残基也是区分TIR-NBS- LRR和nonTIR-NBS-LRR类抗病基因的重要特征[17]，TIR-NBS-LRR类抗病基因中Kinase-2基序最后一个残基都为天冬氨酸（D），而在nonTIR-NBS -LRR类抗病基因中都为色氨酸（W），因此本研究获得的冬瓜RGAs均为nonTIR-NBS-LRR类抗性基因，同源进化分析发现冬瓜RGAs与已知的nonTIR-NBS-LRR类基因RPS2、Mi-1.1、I2C-1聚为一类，因此两种分析结果是一致的。冬瓜RGAs保守结构域也存在较多突变，但未影响到整个保守域性质；保守域外的氨基酸序列变异程度较大，序列整体的相似性变化范围较广（23.2%～100.0%），与其他物种的相似性也在24.7%～99.0%之间。这些点突变、插入和缺失可能是引起冬瓜RGAs多样性的原因。上述研究结果为进化趋异假说提供了一些间接证据[34]。 同源克隆分离R类基因也具有自身局限性，如分离基因具有很大的随机性，获得片段有的不能翻译为完整的氨基酸序列，有的含有保守结构域，但与植物的抗性无关。因此可通过用不同碱基组合的简并引物进行PCR反应，或从不同部位时期cDNA分离RGAs，提高获得不同R序列机会。本研究以黑皮冬瓜“B98K”为试材，同源扩增NBS类抗病基因序列，为进一步克隆冬瓜的功能性抗病基因以及分子标记辅助选择育种提供研究基础，也对进一步研究冬瓜R基因的起源和遗传进化提供借鉴。
参考文献
[1] 中国农业科学院蔬菜花卉研究所. 中国蔬菜品种志[M]. 北京： 中国农业科技出版社， 2001.
[2] 尹晴红， 董敏玉. 冬瓜功能食品对肾系疾患的治疗保健作用[J]. 南京农专学报， 2000， 16（4）： 40.
[3] Diez M J， Pico B， Nuez F. Cucurbit genetic resources in Europe[C]. Adana， Turkey， Ad hoc meeting， 2002，
[4] 谢大森， 何晓明， 赫新洲， 等. 冬瓜主要农艺性状的杂种优势初步分析[J]. 上海农业学报， 2003， 19（2）： 35-37.
[5] 谢大森， 柯 剑， 何晓明， 等. 多抗冬瓜材料的获得及其生理变化规律初步研究[J]. 热带作物学报， 2011， 32（9）： 1 665-1 668.
[6] Gurmuk H S， Steven P B. Reductase activity encode by the Hm1 disease resistance gene in maize[J]. Science， 1992， 258（6）： 985-987.
[7] Liu J L， Liu X L， Dai L Y， et al. Recent progress in elucidating the structure， function and evolution of disease resistance genes in plants[J]. Journal of Genetics and Genomics， 2007， 34（9）： 765-776.
[8] Seah S， Sivasithamparam K， Karakousis A， et al. Cloning and characterization of a family of disease resistance gene analogs from wheat and barley[J]. Theoretical Applied Genetics， 1998， 97： 937-945.
[9] Bent A F. Function meets structure in the study of plant disease resistance genes[J]. Plant Cell， 1996， 8： 1 757-1 771.
[10] 王海燕， 杨文香， 刘大群. 小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J]. 中国农业科学， 2006， 39（8）： 1 558-1 564.
[11] 刘继梅， 程在全， 杨明挚， 等. 云南3种野生稻中抗病基因同源序列的克隆及序列分析[J]. 中国农业科学， 2003， 36（3）： 273-280.
[12] 贺超英， 张志永， 陈受宜. 大豆中NBS类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J]. 科学通报， 2001， 12（4）： 1 017-1 021.
[13] 丁国华， 秦智伟， 刘宏宇， 等. 黄瓜NBS类型抗病基因同源序列的克隆与分析[J]. 园艺学报， 2005， 32（4）： 638-642.
[14] Doyle J J， Doyle J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf material[J]. Phytochemical Bulletin， 1987， 19： 11-15.
[15] 王彦华， 侯喜林， 申书兴，等. 不结球白菜抗病基因同源序列的克隆及分析[J]. 中国农业科学， 2006， 39（12） ： 2 621-2 626.
[16] 刘 洋， 姚全胜， 苏俊波， 等. 芒果NBS类抗病基因同源序列克隆与分析[J]. 植物遗传资源学报， 2013， 14（3）： 571-576.
[17] Meyers B C， Dickerman A W， Michelmore R W， et al. Plant disease resistance genes encode members of an ancient and diverse protein family with the nucleotide-binding superfamily[J]. Plant Journal， 1999， 20： 317-332.
[18] Qilin P， Jonathan W， Kobert F. Divergent evolution of plant NBS-LRR resistance gene homologous in dicot and cereal genomes[J]. J Mol Evol， 2000， 50： 203-213.
[19] He C Y， Zhang Z Y， Chen S Y. Cloning and analysis of a disease resistance gene homolog from soybean[J]. Chinese Science Bulletin， 2001， 46（12）： 1 017-1 021. [20] Baker B， Zambryski E， Staskawicz B， et al. Signaling in plant microbe interaction[J]. Science， 1997， 276： 726-733.
[21] Traut T W. The functions and consensus motifs of nine types of peptide segments that form different types of nucleotide-binding sites[J]. European Journal of Biochemistry， 1994， 222： 9-19.
[22] Ellis J， Dodds P， Pryor T. Structure function and evolution of plant disease resistance genes[J]. Curr Opin Plant Biology， 2000， 3： 278-284.
[23] Belkhadir Y， Subramaniam R， Dangl J L. Plant disease resistance protein signaling： NBS-LRR protein and their partners[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2004， 7： 391-399.
[24] Yuksel B， Estill J C， Schulze S R， et al. Organization and evolution of resistance gene analogs in peanut[J]. Molecular Genetic， 2005， 274： 248-263.
[25] Flor H H. Current status of the gene-for-gene concept[J]. Annual Review of Phytopathology， 1971， 9： 275-296.
[26] Keen N T. Gene-for-gene complementarities in plant-pathogen interactions[J]. Annual Review of Genetics， 1990， 24： 447-463.
[27] 王世全， 张德春， 李 平， 等. 水稻中一个NBS-LRR抗病同源基因家族的克隆和分析[J]. 遗传学报， 2005， 32（7）： 704-711.
[28] 黄 萱， 徐子勤， 陈立余， 等. 小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J]. 分子细胞生物学报， 2006， 39（2）： 91-96.
[29] 陈观水， 周以飞， 林 生， 等. 甘薯NBS类抗病基因类似物的分离与序列分析[J]. 热带亚热带植物学报， 2006， 14（5）： 359-365.
[30] 阙友雄， 许莉萍， 林剑伟， 等. 甘蔗NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J]. 作物学报， 2009， 35（4）： 631-639.
[31] Yuksel B， Estill J C， Schulze S R， et al. Organization and evolution of resistance gene analogs in peanut[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2005， 274： 248-263.
[32] 张向明， 韦靖鸾， 张 丹， 等. 野生稻NBS类抗病基因同源序列的分离与序列分析[J]. 植物遗传资源学报， 2010， 11（6）： 741-748.
[33] 张 楠， 王海燕， 刘大群. 小麦NBS类抗病基因同源cDNA序列的克隆与特征分析[J]. 植物遗传资源学报， 2010， 11（5）： 605-610.
[34] Xu Q， Wen X P， Deng X X. Isolation of TIR NBS-LRR resistance gene an analogues and identification of molecular marker linked to a powdery mildew resistance locus in chestnut rose[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2005， 111： 819-830.