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摘要[目的]提高粪便中犬弓首蛔虫卵的漂浮效果。[方法]对常用的饱和盐水漂浮法进行改良，对2份含犬弓首蛔虫卵的粪便进行漂浮和沉淀等处理。[结果]采用改良漂浮法2个粪便样本中虫卵的回收率分别为52.66%和38.90%，其回收效果较常规漂浮法有明显提高。[结论] 采用吸取表层漂浮液的方式回收漂浮液，对虫卵的回收效果良好。
关键词粪便；犬弓首蛔虫卵；饱和盐水漂浮法；改良
中图分类号S852.7文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-145-03
当代生物学研究中，微量样本作为研究材料的情况已经十分常见，与之适应的微量研究技术已逐步建立起来，但在一些研究工作中还存在不足之处。例如，标准的McMaster法计数虫卵要求虫卵量不少于2 g，而在实际中会遇到如粪便样本不足的情况。2014年9月至11月，从青海西宁市宠物医院和宠物交易市场采集到新鲜的犬粪便27份，初步筛查获得2份含疑似犬弓首蛔虫卵粪样，2份样本的重量分别是9.3和1.6 g，如实现分子生物学等的进一步鉴定需要高质量的虫卵，因此浓缩纯化工作尤为重要。N. Cardillo采用饱和蔗糖漂浮法对粪便中毛弓首蛔虫卵浓缩纯化并计数，计数效果优于McMaster法。饱和蔗糖溶液粘度和漂浮力明显高于饱和盐水，虫卵被漂浮的同时往往会有很多杂质也被漂浮，需要更多的处理，如前期过滤和后期密度梯度离心等，操作手续较为繁杂，且存在技术操作的一定难度。笔者对常用的饱和盐水漂浮法进行改良，以实现简便快捷获得浓缩的虫卵效果。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样本及来源。2份来自西宁市宠物医院和宠物交易市场的新鲜犬粪便，初步筛查均含有疑似犬弓首蛔虫卵，分别编号为Qf1（2014）和Qf2（2014）。
1.1.2试剂。分析纯级NaCl与甲醛，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2方法
1.2.1浓缩纯化方法。按照常规的饱和盐水漂浮操作方法，取2 g粪便，用60 ml饱和盐水稀释，60目铜筛过滤，分装入10 ml玻璃试管，补充少量饱和盐水至液面与试管口成1个平面，静置1 h后，铁丝圈沾取表层液，10 倍物镜镜检。然后，按照N. Cardillo的步骤进行操作，吸取约3 ml上清液，移入15 ml离心管，加入5%福尔马林9 ml，3 000 r/min离心10 min，弃上清，挑去少量沉淀镜检。再加入12 ml 5%福尔马林，重悬沉淀，3 000 r/min离心10 min，弃上清，用少量灭菌蒸馏水重悬沉淀，即为浓缩虫卵，镜检浓缩纯化效果。
1.2.2虫卵计数方法。用改進的McMaster法计数虫卵，计算回收率。
1.2.3造成虫卵损失的因素分析。直接将含虫卵液滴于载玻片上，不加盖玻片镜检；然后，吸去液滴，再观察载玻片。
1.2.4简易浓缩纯化方案制定与检验。根据上述工作的结果，拟定浓缩纯化方案，并用样本进行效果检验。
2结果与分析
2.1常规漂浮处理后的镜检结果
常规程序的漂浮液在100倍的视野中，虫卵轮廓清晰，但内部结构不太明显，同时有大量杂质存在（图1A）。经过浓缩后镜检，可观察到的虫卵量并不多，同时颜色较深的杂质也明显减少（图1B）。由表1可知，McMaster法计数回抽率不到10%。
2.2虫卵损失因素分析
在同时开展的另一工作中，为了了解卵壳的裂解情况，用经过冻融后的虫卵液，直接滴于载玻片上，不加盖玻片镜检，可见虫卵在液滴最上表层聚集（图2A）。然后吸去液滴，再观察载玻片，能见到有许多虫卵分散分布在载玻片上（图2B）。这可能提示虫卵丢失严重的原因是虫卵与容器壁的吸附，也是文献中提到注意清洗管壁的操作的原因。虫卵在漂浮态时多集聚于液体上表层，也提示浓缩虫卵可以直接回收漂浮液的上表层。
同时，还注意到虫卵经12 000 r/min离心5 min，再经过组织裂解液处理，卵壳有破损，但虫卵的卵壳内其余结构仍然保存完好（图2C）。这说明高速离心可以用于虫卵的分离操作。
2.3简易浓缩纯化方案
①挑去约0.05 g粪便放入2 ml离心管中，加500 μl饱和盐水，破碎粪便并与饱和盐水混匀。②静置10 min后吸取少量上清稀释后镜检计数，计数后把计数板上液体回收并用饱和盐水冲洗计数板2～3次。冲洗液回收到新离心管中，补加饱和盐水至液面凸出离心管口，小心吸取上表层液，放入新的2 ml离心管A；③在原离心管中补加饱和盐水至1 500 μl，4 000 r/min离心10 min。然后，缓慢补加饱和盐水至液面凸出离心管口，小心吸取表层上清约100 μl放入离心管A，重复操作1次。④在离心管A中的上清液中，加入1 ml 5%的福尔马林混匀，静置过夜。⑤10 000 r/min离心5 min，小心吸去上层上清液约1 ml。重新加入1 ml灭菌蒸馏水混匀，10 000 r/min离心5 min，吸去大部分上清液。⑥余液约100 μl，加入1 ml灭菌蒸馏水混匀，10 000 r/min离心，弃上清，沉淀用100 μl 的生理盐水重悬，4 ℃或更低温度下保存备用。
2.4浓缩纯化效果
对浓缩纯化过程中的上清和沉淀混悬液镜检见图3，浓缩纯化的回收率见表1。微量粪便样本漂浮处理，较大量粪便处理的视野中杂质量相对较少，虫卵形态相对清晰；经过初次高速离心后的成点重悬液中，仍然有一定量的杂质；完成浓缩纯化操作后的样本，视野中几乎看不到杂质的存在，但也可以注意到虫卵量有减少迹象，2个样本的回收率分别为52.66%和38.90%，较常规漂浮法回收效果有明显提高。
3讨论
3.1与饱和蔗糖漂浮法的比较 饱和蔗糖液的比重128，液体粘稠度很大，漂浮前必须经过过滤处理和长时间静置，如果短时间内处理，必将增加漂浮层中的杂质含量。饱和盐水的比重为1.17～1.20，与饱和硫酸锌比重（118）接近，明显减少了漂浮层的杂质成分，这可能是因为蛔虫卵比重（1.16）与饱和盐水比重相近有关。但是，蛔虫卵的比重有变化，饱和盐水的比重也随环境温度的不同而不同，可能造成不同研究中的漂效果不一致。在对吸取表层液的剩余漂浮液镜检中发现偶有虫卵存在，提示比重的不稳定可能是该研究中的部分虫卵丢失的原因之一，因此选择
比重略高于蟲卵比重的漂浮液可能会比饱和盐水更适合。
3.2与密度梯度离心技术的比较
密度梯度离心是分离技术中效果最为理想的方法之一，从简单的处理和设备的要求方面考虑，密度梯度离心所需条件相对较高。为了简化条件和技术难度，采用了通过饱和盐水、5%福尔马林和灭菌蒸馏水轮换的方式替代密度梯度，并用不同的离心速度加速这种替代的密度梯度作用，研究表明此方式确实提高了分离的实际效果，也简化了大量操作的手续。
3.3高速离心对虫卵的影响
常规的细胞离心速度以低速为主，差异大多因使用的介质和离心机的不同而不同。相同介质中离心速度过高，细胞损伤程度越大。寄生虫的卵细胞外层多包有较厚的一层蛋白膜，这是保护其在各种环境中存活的方式。因此，利用虫卵分离蛋白或核酸时，破碎虫卵往往需要采用液氮冻融、蛋白酶K消化以及超声裂解等相结合的方式。在另一研究中，将虫卵裂解后经12 000 r/min离心5 min的沉淀涂片镜检，可见有较多的虫卵还未被彻底裂解，这是笔者采用10 000 r/min的离心转速对虫卵的破坏程度不大的证据，最终的纯化结果也说明了这一点。
3.4虫卵自身特性对纯化浓缩的影响
为了不浪费虫卵液，镜检均直接观察液滴，不加盖盖玻片。镜头下面的虫卵多集中在液面最上端，回收液滴后镜检载玻片可看到仍有许多虫卵分散残留，需清洗几次才能全部回收，与N. Cardillo的浓缩方法相一致。这个现象一方面说明常规漂浮中虫卵大量丢失的原因之一，另一方面也提示采用吸取突出离心管口的表层液面的方法，是充分回收虫卵的关键。如果结合选择合适的漂浮介质，漂浮效果将更加明显。
3.5改良方法的推广
构建和检验方法的2个样本中Qf1的虫卵含量很高，而Qf2的虫卵含量比较低，严格按照方法的步骤操作，Qf2的回收效果并不理想。因此，在遇到这种情况时建议增加粪便的用量，静置时间延长至3 h以上，同时减少低速离心的次数，而增加收集凸起上层液的次数，同时结合显微镜检来确定虫卵收集程度。笔者所建立的方法是针对微量粪便样本，方法中的关键技术同样适用于大量粪便的操作，如可选取容量大但开口相对小的容器漂浮虫卵，保证液面凸出瓶口即可。
犬类动物粪便的杂质颗粒较细小，而草食类动物粪便多有未消化的植物纤维，这2种不同的粪便的前期处理应有差别。该研究中省略了用蒸馏水混悬沉淀和粗筛过滤，正是基于此。对于草食类动物粪便，可在初步了解虫卵大小的前提下，经过适合孔径筛子过滤后可以按照此方法进行相应虫卵的纯化浓缩。
43卷21期繁 萍等粪便中犬弓首蛔虫卵饱和盐水卵漂浮法的改良研究
参考文献
[1] CARDILLO N， SOMMERFELT I， FARINA F， et al.A Toxocara cati eggs concentration method from cats’faeces[J]. Experimental Parasitology， 2014，144：73-75.
[2] OVERGAAU P A M， VAN KNAPEN F. Toxocarosis， an important zoonosis[J].Eur J Comp Anim Pract，2008，18：259-266.
[3] 李影林.中华医学检验全书[M]. 北京：人民卫生出版社，1996：2469.
[4] 虞春华，连金泉，刘建军.寄生虫卵漂浮法检验中不同饱和溶液的检测结果[J].临床分析中华医院感染学杂志，2013，23（20）：5112-5114.周荣琼，夏庆友，黄汉成，等.犬弓首蛔虫ITS1基因的克隆及序列分析[J].中国预防兽医学报，2010，32（10）：818-820.
[5] 钱颖骏， 诸廷俊， 王聚君，等.4种漂浮法分离土壤中人蛔虫卵的效果比较[J].中国病原生物学杂志，2008，3（4）：305-306.
[6] 白玲英. 粪便中犬弓首蛔虫卵DNA抽提方法研究[D].西宁：青海大学，2015.
[7] 詹希美.人体寄生虫学[M]. 2版.北京：人民卫生出版社，2010.
[8] 空军杭州疗养院检验科.饱和盐水漂浮法结合沉淀镜检法的应用[J].临床检验杂志，1984（4）：52.
[9] 谭天伟. 生物分离技术[M]. 北京：化学工业出版社，2007.
[10] PONCEMACOTELA M，RODRGUEZCABALLERO A，PERALTAABARCA G E，et al. A simplified method for hatching and isolating Toxocara canis larvae to facilitate excretorysecretory antigen collection in vitro[J]. Vet Parasitology，2011，175：382-385.
[11] 吴绍强，林祥梅，韩雪清，等.泡菜中蛔虫卵荧光PCR检测方法的建立及应用[J].食品科学，2007，28（11）：345-349.
关键词粪便；犬弓首蛔虫卵；饱和盐水漂浮法；改良
中图分类号S852.7文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-145-03
当代生物学研究中，微量样本作为研究材料的情况已经十分常见，与之适应的微量研究技术已逐步建立起来，但在一些研究工作中还存在不足之处。例如，标准的McMaster法计数虫卵要求虫卵量不少于2 g，而在实际中会遇到如粪便样本不足的情况。2014年9月至11月，从青海西宁市宠物医院和宠物交易市场采集到新鲜的犬粪便27份，初步筛查获得2份含疑似犬弓首蛔虫卵粪样，2份样本的重量分别是9.3和1.6 g，如实现分子生物学等的进一步鉴定需要高质量的虫卵，因此浓缩纯化工作尤为重要。N. Cardillo采用饱和蔗糖漂浮法对粪便中毛弓首蛔虫卵浓缩纯化并计数，计数效果优于McMaster法。饱和蔗糖溶液粘度和漂浮力明显高于饱和盐水，虫卵被漂浮的同时往往会有很多杂质也被漂浮，需要更多的处理，如前期过滤和后期密度梯度离心等，操作手续较为繁杂，且存在技术操作的一定难度。笔者对常用的饱和盐水漂浮法进行改良，以实现简便快捷获得浓缩的虫卵效果。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样本及来源。2份来自西宁市宠物医院和宠物交易市场的新鲜犬粪便，初步筛查均含有疑似犬弓首蛔虫卵，分别编号为Qf1（2014）和Qf2（2014）。
1.1.2试剂。分析纯级NaCl与甲醛，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2方法
1.2.1浓缩纯化方法。按照常规的饱和盐水漂浮操作方法，取2 g粪便，用60 ml饱和盐水稀释，60目铜筛过滤，分装入10 ml玻璃试管，补充少量饱和盐水至液面与试管口成1个平面，静置1 h后，铁丝圈沾取表层液，10 倍物镜镜检。然后，按照N. Cardillo的步骤进行操作，吸取约3 ml上清液，移入15 ml离心管，加入5%福尔马林9 ml，3 000 r/min离心10 min，弃上清，挑去少量沉淀镜检。再加入12 ml 5%福尔马林，重悬沉淀，3 000 r/min离心10 min，弃上清，用少量灭菌蒸馏水重悬沉淀，即为浓缩虫卵，镜检浓缩纯化效果。
1.2.2虫卵计数方法。用改進的McMaster法计数虫卵，计算回收率。
1.2.3造成虫卵损失的因素分析。直接将含虫卵液滴于载玻片上，不加盖玻片镜检；然后，吸去液滴，再观察载玻片。
1.2.4简易浓缩纯化方案制定与检验。根据上述工作的结果，拟定浓缩纯化方案，并用样本进行效果检验。
2结果与分析
2.1常规漂浮处理后的镜检结果
常规程序的漂浮液在100倍的视野中，虫卵轮廓清晰，但内部结构不太明显，同时有大量杂质存在（图1A）。经过浓缩后镜检，可观察到的虫卵量并不多，同时颜色较深的杂质也明显减少（图1B）。由表1可知，McMaster法计数回抽率不到10%。
2.2虫卵损失因素分析
在同时开展的另一工作中，为了了解卵壳的裂解情况，用经过冻融后的虫卵液，直接滴于载玻片上，不加盖玻片镜检，可见虫卵在液滴最上表层聚集（图2A）。然后吸去液滴，再观察载玻片，能见到有许多虫卵分散分布在载玻片上（图2B）。这可能提示虫卵丢失严重的原因是虫卵与容器壁的吸附，也是文献中提到注意清洗管壁的操作的原因。虫卵在漂浮态时多集聚于液体上表层，也提示浓缩虫卵可以直接回收漂浮液的上表层。
同时，还注意到虫卵经12 000 r/min离心5 min，再经过组织裂解液处理，卵壳有破损，但虫卵的卵壳内其余结构仍然保存完好（图2C）。这说明高速离心可以用于虫卵的分离操作。
2.3简易浓缩纯化方案
①挑去约0.05 g粪便放入2 ml离心管中，加500 μl饱和盐水，破碎粪便并与饱和盐水混匀。②静置10 min后吸取少量上清稀释后镜检计数，计数后把计数板上液体回收并用饱和盐水冲洗计数板2～3次。冲洗液回收到新离心管中，补加饱和盐水至液面凸出离心管口，小心吸取上表层液，放入新的2 ml离心管A；③在原离心管中补加饱和盐水至1 500 μl，4 000 r/min离心10 min。然后，缓慢补加饱和盐水至液面凸出离心管口，小心吸取表层上清约100 μl放入离心管A，重复操作1次。④在离心管A中的上清液中，加入1 ml 5%的福尔马林混匀，静置过夜。⑤10 000 r/min离心5 min，小心吸去上层上清液约1 ml。重新加入1 ml灭菌蒸馏水混匀，10 000 r/min离心5 min，吸去大部分上清液。⑥余液约100 μl，加入1 ml灭菌蒸馏水混匀，10 000 r/min离心，弃上清，沉淀用100 μl 的生理盐水重悬，4 ℃或更低温度下保存备用。
2.4浓缩纯化效果
对浓缩纯化过程中的上清和沉淀混悬液镜检见图3，浓缩纯化的回收率见表1。微量粪便样本漂浮处理，较大量粪便处理的视野中杂质量相对较少，虫卵形态相对清晰；经过初次高速离心后的成点重悬液中，仍然有一定量的杂质；完成浓缩纯化操作后的样本，视野中几乎看不到杂质的存在，但也可以注意到虫卵量有减少迹象，2个样本的回收率分别为52.66%和38.90%，较常规漂浮法回收效果有明显提高。
3讨论
3.1与饱和蔗糖漂浮法的比较 饱和蔗糖液的比重128，液体粘稠度很大，漂浮前必须经过过滤处理和长时间静置，如果短时间内处理，必将增加漂浮层中的杂质含量。饱和盐水的比重为1.17～1.20，与饱和硫酸锌比重（118）接近，明显减少了漂浮层的杂质成分，这可能是因为蛔虫卵比重（1.16）与饱和盐水比重相近有关。但是，蛔虫卵的比重有变化，饱和盐水的比重也随环境温度的不同而不同，可能造成不同研究中的漂效果不一致。在对吸取表层液的剩余漂浮液镜检中发现偶有虫卵存在，提示比重的不稳定可能是该研究中的部分虫卵丢失的原因之一，因此选择
比重略高于蟲卵比重的漂浮液可能会比饱和盐水更适合。
3.2与密度梯度离心技术的比较
密度梯度离心是分离技术中效果最为理想的方法之一，从简单的处理和设备的要求方面考虑，密度梯度离心所需条件相对较高。为了简化条件和技术难度，采用了通过饱和盐水、5%福尔马林和灭菌蒸馏水轮换的方式替代密度梯度，并用不同的离心速度加速这种替代的密度梯度作用，研究表明此方式确实提高了分离的实际效果，也简化了大量操作的手续。
3.3高速离心对虫卵的影响
常规的细胞离心速度以低速为主，差异大多因使用的介质和离心机的不同而不同。相同介质中离心速度过高，细胞损伤程度越大。寄生虫的卵细胞外层多包有较厚的一层蛋白膜，这是保护其在各种环境中存活的方式。因此，利用虫卵分离蛋白或核酸时，破碎虫卵往往需要采用液氮冻融、蛋白酶K消化以及超声裂解等相结合的方式。在另一研究中，将虫卵裂解后经12 000 r/min离心5 min的沉淀涂片镜检，可见有较多的虫卵还未被彻底裂解，这是笔者采用10 000 r/min的离心转速对虫卵的破坏程度不大的证据，最终的纯化结果也说明了这一点。
3.4虫卵自身特性对纯化浓缩的影响
为了不浪费虫卵液，镜检均直接观察液滴，不加盖盖玻片。镜头下面的虫卵多集中在液面最上端，回收液滴后镜检载玻片可看到仍有许多虫卵分散残留，需清洗几次才能全部回收，与N. Cardillo的浓缩方法相一致。这个现象一方面说明常规漂浮中虫卵大量丢失的原因之一，另一方面也提示采用吸取突出离心管口的表层液面的方法，是充分回收虫卵的关键。如果结合选择合适的漂浮介质，漂浮效果将更加明显。
3.5改良方法的推广
构建和检验方法的2个样本中Qf1的虫卵含量很高，而Qf2的虫卵含量比较低，严格按照方法的步骤操作，Qf2的回收效果并不理想。因此，在遇到这种情况时建议增加粪便的用量，静置时间延长至3 h以上，同时减少低速离心的次数，而增加收集凸起上层液的次数，同时结合显微镜检来确定虫卵收集程度。笔者所建立的方法是针对微量粪便样本，方法中的关键技术同样适用于大量粪便的操作，如可选取容量大但开口相对小的容器漂浮虫卵，保证液面凸出瓶口即可。
犬类动物粪便的杂质颗粒较细小，而草食类动物粪便多有未消化的植物纤维，这2种不同的粪便的前期处理应有差别。该研究中省略了用蒸馏水混悬沉淀和粗筛过滤，正是基于此。对于草食类动物粪便，可在初步了解虫卵大小的前提下，经过适合孔径筛子过滤后可以按照此方法进行相应虫卵的纯化浓缩。
43卷21期繁 萍等粪便中犬弓首蛔虫卵饱和盐水卵漂浮法的改良研究
参考文献
[1] CARDILLO N， SOMMERFELT I， FARINA F， et al.A Toxocara cati eggs concentration method from cats’faeces[J]. Experimental Parasitology， 2014，144：73-75.
[2] OVERGAAU P A M， VAN KNAPEN F. Toxocarosis， an important zoonosis[J].Eur J Comp Anim Pract，2008，18：259-266.
[3] 李影林.中华医学检验全书[M]. 北京：人民卫生出版社，1996：2469.
[4] 虞春华，连金泉，刘建军.寄生虫卵漂浮法检验中不同饱和溶液的检测结果[J].临床分析中华医院感染学杂志，2013，23（20）：5112-5114.周荣琼，夏庆友，黄汉成，等.犬弓首蛔虫ITS1基因的克隆及序列分析[J].中国预防兽医学报，2010，32（10）：818-820.
[5] 钱颖骏， 诸廷俊， 王聚君，等.4种漂浮法分离土壤中人蛔虫卵的效果比较[J].中国病原生物学杂志，2008，3（4）：305-306.
[6] 白玲英. 粪便中犬弓首蛔虫卵DNA抽提方法研究[D].西宁：青海大学，2015.
[7] 詹希美.人体寄生虫学[M]. 2版.北京：人民卫生出版社，2010.
[8] 空军杭州疗养院检验科.饱和盐水漂浮法结合沉淀镜检法的应用[J].临床检验杂志，1984（4）：52.
[9] 谭天伟. 生物分离技术[M]. 北京：化学工业出版社，2007.
[10] PONCEMACOTELA M，RODRGUEZCABALLERO A，PERALTAABARCA G E，et al. A simplified method for hatching and isolating Toxocara canis larvae to facilitate excretorysecretory antigen collection in vitro[J]. Vet Parasitology，2011，175：382-385.
[11] 吴绍强，林祥梅，韩雪清，等.泡菜中蛔虫卵荧光PCR检测方法的建立及应用[J].食品科学，2007，28（11）：345-349.