胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)来源于发育分化早期囊胚的内细胞团，适当条件下能在体外维持未分化状态、正常二倍体核型及无限增殖能力，且具有多向分化潜能，能够发育分化成机体三个胚层的所有类型细胞。ESCs已被广泛用于细胞、组织和器官的修复和移植、发育生物学、克隆动物制作、动物医学模型建立、基因功能研究、药物筛选以及细胞分化机制的探索等领域，具有广阔的应用前景。 目前利用ESCs已经在体外成功的诱导分化为起源于三个胚层的多种细胞，其中神经元细胞、肝细胞、胰岛细胞、心肌细胞的诱导分化研究较多，相关技术较为成熟，已用于临床的替代治疗，取得令人鼓舞的成果。 随着加碘盐的普及，以及饮食习惯和生活节奏的变化，我国甲状腺功能亢进症(简称甲亢)的发病率逐年升高。在药物、手术、放射性<131>Ⅰ三种甲亢治疗方法中，<131>Ⅰ治疗甲亢以其疗效确切、治愈率高以及费用低，副反应少被越来越多的甲亢患者和临床医生认可。但<131>Ⅰ治疗甲亢的最大不足是治愈后有部分病人会出现甲状腺功能减低(简称甲减)，尤其是治疗后最初10年内永久性甲减发生率以每年2﹪～5﹪的比例增加，这种副作用严重影响了<131>Ⅰ治疗甲亢的发展和深入。甲减是一种严重影响生存质量的疾病，其主要的治疗方法是服用甲状腺素替代治疗；虽然绝大多数病人服用甲状腺素后可正常生活，但病人难以接受终生服用甲状腺素的现实；另外，有少量病人对甲状腺素的替代用量很敏感，难以控制最佳剂量；而部分冠心病病人不适用甚至忌用甲状腺素。因此有必要探求新的治疗甲减的可行办法，ESCs的多向发育潜能为甲减治疗带来了潜在希望。研究目的1、探讨体外诱导ESCs分化为甲状腺细胞的可行性和相关调节因子； 2、除了从基因水平，分子水平定性诱导细胞中存在甲状腺细胞的基础上，进一步研究诱导甲状腺细胞的分泌功能； 3、在贴壁诱导ESCs分化为甲状腺细胞可行的基础上，利用鼠尾胶原构建三维立体结构，探讨三维结构诱导ESCs分化为甲状腺细胞的可行性及潜在的滤泡功能重建优势。 实验方法 该实验分两部分：贴壁诱导和三维立体结构诱导。在贴壁诱导中，优化ESCs的体外培养条件，取生长状况良好、未分化的E14小鼠ESCs，先将其悬浮培养诱导发育为拟胚体(：Embryoid bodies,EBs)，再继续贴壁诱导EBs分化，在诱导期的不同阶段，添加TSH、KI、Insulin作为诱导因子。倒置显微镜下观察细胞分化过程中的形态学变化，RT-PCR法检测诱导细胞中甲状腺细胞特异性基因TSHR、NIS、TPO、Tg等的表达情况，激光共聚焦显微镜双色荧光检测PAX8和TTF1的共表达情况(PAX8和TTF1的共表达只出现在甲状腺细胞前体及成熟甲状腺细胞中)，电子显微镜观察诱导细胞的超微结构，寻找内分泌类似细胞及可能存在的内分泌颗粒。 在鼠尾胶原三维诱导中，利用鼠尾跟腱自制鼠尾胶原，构建立体结构；筛选生长状况良好、未分化的ESCs，先将其悬浮培养诱导发育为拟胚体(Embryoidbodies．EBs)，接种EBs于鼠尾胶原继续诱导，诱导过程中所添加的诱导因子及添加时程同贴壁诱导；倒置显微镜观察细胞分化过程中的形态学变化，电子显微镜观察可能存在的滤泡样结构及诱导细胞的超微结构，寻找内分泌颗粒。实验结果ESCs在小鼠胚胎成纤维细胞构建的滋养层上生长状况良好，保持未分化状态；脱滋养层后在重组小鼠白血病抑制因子(rmLIF)存在的条件下继续保持未分化状态。撤去rmLIF后很快发育为拟胚体并继续分化。RT-PCR结果示，在诱导分化的第8天及第10天，诱导细胞可检测到甲状腺细胞分化特有基因TSHR、Tg、TPO、NIS等的表达；双色免疫荧光结果示，部分诱导细胞同时表达PAX8和TTF1，甲状腺细胞分化率约2﹪～3﹪；电镜下观察诱导细胞的超微结构示，部分细胞可见微绒毛，胞质内高尔基体及内质网较丰富，未见到颗粒样物质。三维诱导中，拟胚体不易贴壁，诱导细胞向四周爬开的速度较慢，分化细胞渐陷入鼠尾胶原：电镜可见部分细胞呈抱团状生长，微绒毛、高尔基、内质网丰富，胞质内可见均质的、膜包被的、稍低电子密度的颗粒样物质。 结论 胚胎干细胞经过拟胚体阶段，在一定培养条件和诱导因子作用下，可定向分化为甲状腺细胞。两种诱导方法中均见部分诱导细胞的高尔基体、内质网较丰富，具备合成、分泌的功能，在三维诱导中，细胞胞质内可见颗粒样物质。由于甲状腺细胞的分泌功能除了需要较成熟的滤泡结构外，还需要细胞外基质及其它外界条件调节，体外的诱导环境相对简单；另外，甲状腺细胞的分化率相对较低；所以该研究虽证实了ESCs在一定条件下可体外分化为甲状腺细胞，但距离甲状腺功能减低的替代治疗尚有一定距离。