研究背景:膀胱癌是世界第十大肿瘤。北美和欧洲等发达地区发病率高于其他地区。2018年,全球估算新发膀胱癌549,000例,另有200,000人死于本病。膀胱癌的发病率男性高于女性,高发于50-70岁之间。对于高分期的膀胱癌患者,化疗是一种重要的辅助治疗手段。然而,现有化疗药物尚存很多问题有待解决,如:化疗过程中肿瘤出现耐药、严重副反应等问题。因此,研发新的化疗药物有很大的意义。重楼皂苷I（PPI）是一种植物根茎提取物,来源于百合科植物——重楼。近年来,研究人员发现PPI对多种癌症有很强的杀伤作用。但是PPI对膀胱癌的作用尚无相关报道。研究目的:从细胞和动物层面探索PPI是否对膀胱癌有抗癌作用。若PPI可以杀伤膀胱癌,则继续在分子层面阐述该现象的内在机制。实验方法:体外实验:以人类膀胱癌细胞系为工具,研究PPI对膀胱癌细胞的杀伤作用。利用CCK8法检测不同浓度PPI对膀胱癌细胞系的抑制效果,测定IC50值。选择对PPI最敏感的膀胱癌细胞系进行后续克隆形成、细胞凋亡、细胞周期以及线粒体膜电位检测。免疫印迹法检测细胞凋亡、细胞周期关键蛋白表达改变。利用全转录组测序分析PPI对膀胱癌细胞内基因表达影响,分析发生显著改变的信号通路。免疫印迹法验证全转录组测序分析中预测的信号通路关键蛋白表达情况。利用免疫荧光法检测关键蛋白在膀胱癌细胞中的定位变化。siRNA沉默关键信号通路基因后,再次测试PPI对膀胱癌细胞的杀伤作用。体外实验:构建原位膀胱癌裸鼠动物模型,将荷瘤小鼠随机分组后,定期予PPI或生理盐水腹腔注射。使用动物成像仪观测不同组别的肿瘤光学信号变化。定期称量实验动物的体重变化。使用免疫组化观察两组膀胱肿瘤的关键信号通路蛋白表达情况。实验结果:较小浓度的PPI即可对膀胱癌细胞产生强大的抑制效果,其中T24和UMUC3膀胱癌细胞系对PPI处理最敏感。随着给药浓度和处理时间的增加,PPI抑制膀胱癌细胞克隆形成、诱导膀胱癌凋亡的效应显著升高。细胞周期检测发现PPI可以导致T24和UMUC3细胞的细胞周期分别阻滞于G2/M和S期。此外利用JC-1荧光探针,我们发现PPI还可以使膀胱癌细胞的线粒体膜电位下降。免疫印迹实验发现,在前述处理后的膀胱癌细胞中,凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3和细胞周期调控蛋白p21表达升高。全转录组测序发现PPI分别使T24和UMUC3细胞出现6254及1304个基因的表达改变,其中共同上下调的基因有338个,对这338个基因进行信号通路富集分析,发现FOXO3信号通路可能出现了激活。进一步免疫印迹实验发现PPI可以升高膀胱癌细胞中FOXO3转录因子及其下游目标蛋白BIM和NOXA的表达水平。免疫荧光检测亦发现FOXO3转录因子在PPI刺激下出现入核现象。鉴于FOXO3信号通路在膀胱癌细胞中出现重要改变,我们在T24细胞中沉默了FOXO3基因,再次予PPI处理。实验发现沉默FOXO3基因可以部分逆转PPI对膀胱癌的促凋亡以及阻滞细胞周期的作用。动物实验显示,PPI可以显著抑制膀胱原位肿瘤在裸鼠体内的生长,且PPI并未导致裸鼠体重明显下降。免疫组化发现PPI处理组的肿瘤FOXO3表达升高。结论:本研究发现,PPI通过抑制肿瘤生长、诱导细胞凋亡以及阻滞细胞周期对膀胱癌发挥杀伤作用。此外我们发现,PPI通过激活FOXO3信号通路发挥前述效应。综上,我们认为PPI可以被列为膀胱癌化疗的候选分子药物。