铜绿假单胞菌是一种条件性致病菌,其多重毒力和耐药性,是导致临床治疗失败的关键因素。蛋白质的磷酸化修饰是细胞调节和控制蛋白质功能的最普遍的机制,增强了对蛋白质功能发挥的调控作用。近年来研究表明,细菌中存在的真核样Ser/Thr蛋白激酶介导的磷酸化修饰参与细菌毒力和耐药性的调控。铜绿假单胞菌stk1已被证实编码Ser/Thr蛋白激酶,但目前对该基因的功能及其在该菌毒力和耐药中的作用尚不清楚。本实验首先构建了铜绿假单胞菌PAO1的stk1基因敲除菌Δstk1,随后从绿脓菌素分泌、运动性和生菜毒力等毒力方面,以及胞外多糖分泌、生物被膜形成能力和抗生素MIC等耐药性方面来检测PAO1和Δstk1之间的差异。结果表明,与PAO1相比,Δstk1的绿脓菌素和胞外多糖分泌减少,蹭行运动能力减弱,对生菜毒力增强,对头孢他啶和庆大霉素的耐药性提高,对氯霉素的耐药性下降。为了进一步确认Stk1的作用,利用磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸泛抗体,分析了PAO1和Δstk1的膜蛋白磷酸化图谱,结果表明,PAO1和Δstk1的膜蛋白磷酸化图谱存在明显差异,暗示了Stk1的激酶活性的重要性。AlgR是一种转录调控因子,含有Stk1能识别特定的磷酸化位点基序SAR。研究表明该蛋白参与绿农菌素分泌,藻烷酸盐(胞外多糖)分泌和蹭行运动的调控。因此推测Stk1通过磷酸化修饰AlgR来发挥调控作用。为证实这种调控作用,构建了Stk1和AlgR的表达菌株,通过亲和层析方法纯化得到Stk1和AlgR两种蛋白。随后进行体外磷酸化反应,结果表明Stk1可以磷酸化AlgR。为了进一步探究Stk1是否通过AlgR发挥调控作用,通过荧光定量PCR检测AlgR调控的相关基因表达水平;结果表明,Stk1通过AlgR调控铜绿假单胞菌绿脓菌素和藻烷酸盐的分泌,并通过其它途径影响菌毛介导的蹭行运动。本文揭示了Stk1在铜绿假单胞菌毒力和耐药性中的作用,并初步确定其通过调控因子AlgR发挥调控的分子机制,不仅为全面揭示铜绿假单胞菌毒力和耐药的分子机制奠定基础,同时也为该菌的感染和临床治疗提供新思路。