目的:熊果酸（Ursolic acid,UA）是一种具有抗癌活性的五环三萜类天然产物,据报道它在多种癌细胞系中都显示出良好的抗癌活性。但是由于生物利用度不高,其临床应用受到限制。本课题组在前期的实验中设计并合成了一系列UA的衍生化合物,以期开发为活性更高的抗癌药物。UA232是其中抗癌效果最强,且显著高于UA的衍生小分子化合物。本研究对UA232的抗癌药理机制进行深入研究,以期为抗癌药物的设计和开发提供新的研究思路和理论依据。方法:本研究以人宫颈癌Hela细胞和乳腺癌MCF-7细胞为研究对象,以正常的人胚肾HEK293T细胞为对照,通过CCK8实验检测UA232对细胞活力的影响,并采用平板克隆形成实验检测UA232对上述两种癌细胞的增殖能力的影响。采用流式细胞术检测UA232对细胞周期分布的影响。通过Annexin V-FITC/PI双染法检测UA232对细胞凋亡的影响,并利用Western blot技术分析介导细胞凋亡的具体信号通路。采用Western blot和免疫荧光技术检测细胞自噬水平,使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制细胞自噬后,通过流式细胞术确定UA232诱导的自噬对细胞凋亡的影响。为了研究自噬通量被抑制的原因,采用免疫荧光共定位技术分析自噬体和溶酶体的融合能力,采用溶酶体红色荧光探针Lyso-Tracker Red评估溶酶体的酸性变化,采用实时荧光定量PCR技术（Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR,Real-Time qPCR）检测包括转录因子 EB（Transcription factor EB,TFEB）及其下游与溶酶体生物发生相关基因的mRNA表达水平,采用免疫荧光共定位技术分析溶酶体膜通透性的改变,并使用CA-074-ME抑制组织蛋白酶B（Cathepsin B,CTSB）的活性后,通过流式细胞术分析渗漏的CTSB对细胞凋亡的影响。结果:CCK8实验表明UA232在Hela和MCF-7细胞中呈现剂量依赖性细胞毒性（IC50值分别为5.7 μM和4.1μM）,其细胞毒性比UA232在正常人胚肾细胞HEK-293T中的毒性（IC50>40 μM）和UA在Hela及MCF-7细胞中的毒性（IC50值分别为29.7μM和26.1 μM）更强。细胞周期实验结果表明UA232在两种细胞系中均诱导了G0/G1期阻滞。细胞凋亡实验和Western blot的结果表明UA232诱导细胞凋亡,且该过程不依赖于线粒体凋亡途径或死亡受体凋亡途径,而是与严重的未折叠蛋白质反应过程密切相关,在这个过程中PERK-ATF4-CHOP信号通路被激活。Western blot和免疫荧光实验的结果显示,UA232给药处理后,细胞中的LC-3Ⅱ和p62的表达均增加,提示UA232阻断了细胞的自噬通量;流式细胞术结果表明加入自噬抑制剂3-MA后,细胞凋亡减少,证明该自噬过程在细胞死亡的过程中扮演保护性的角色。免疫荧光共定位的结果显示,UA232没有阻碍自噬体和溶酶体的融合;Lvso-Tracker Red探针标记溶酶体的实验表明,UA232给药组的细胞荧光强度明显低于对照组,表明UA232碱化了细胞中的溶酶体;Real-Time qPCR的结果表明溶酶体生物发生被激活;CTSB和LAMP2免疫荧光共定位的结果表明UA232诱导溶酶体膜透化,导致CTSB等大分子从溶酶体中渗漏到细胞质中;用CA-074-ME抑制CTSB活性后,细胞凋亡减少,证明CTSB介导了溶酶体依赖性的细胞凋亡。结论:UA的衍生物UA232具有很强的抗癌活性。一方面UA232诱发严重的内质网应激和未折叠蛋白质反应,激活PERK-ATF4-CHOP信号通路从而诱导细胞凋亡;另一方面UA232碱化溶酶体,使溶酶体功能受损,溶酶体膜通透性增强,溶酶体内的大分子物质渗漏到细胞质中引发溶酶体依赖性的细胞凋亡。此外,由于溶酶体受损导致自噬通量被抑制,使癌细胞内的自噬稳态失调,最终使UA232表现出强烈的抗癌效果。