2株鸭源NDV的生物学特性研究及全基因组分析

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为了解鸭源NDV分离株的毒力特点、全基因序列差异及遗传进化规律,本研究对2株鸭源NDV103株和104株进行了毒力测定、对SPF鸡和非免疫健康鸭进行了致病性试验、对非免疫健康鸭感染后不同脏器中的复制情况进行了研究;在此基础上,通过RT-PCR方法测定了2株病毒的全基因组序列,同23株其他NDV序列进行了比较,分析了各毒株基因组之间的差异。   对2株鸭源NDV103株和104株MDT、ICPI和IVPI进行了测定,NDV103株分别为58.5h、1.925和1.77,NDV104株分别为49.71h、1.95和1.64,检测结果表明该2株毒株均为强毒株。将NDV103和NDV104对7日龄、30日龄SPF鸡及7日龄、30日龄非免疫健康番鸭进行了致病性试验,30日龄番鸭没有发病或死亡,但是其他攻毒组死亡率均为100%。为进一步了解这2株病毒在感染7日龄、30日龄番鸭后不同脏器中的复制情况,在感染后第3d、5d、7d采集肝、肾、肺、脾、气管和胰腺等脏器进行了病毒滴度测定。测定结果如下:NDV103株感染番鸭后第5d各脏器中的病毒滴度最高,而NDV104株在感染番鸭后第3d滴度达到高峰,并且持续到第5d,2株病毒感染不同日龄的番鸭后第7d均只能在少数脏器中检测到病毒。检测结果还显示NDV103株感染不同日龄番鸭后,病毒滴度在相同时间同一脏器中相近,NDV104株感染后病毒滴度也表现出相似的现象。   对NDV103株和NDV104株的基因组分析结果表明,其基因组总长均为15192nt,长度符合“六的倍数”规则。2株病毒的基因组3'末端(Leader)和5'末端(Trailer)长度均相同,分别为55nt和114nt;其基因组均含有6个ORF,编码NP、P、M、F、HN和L等6种蛋白,每个基因有相同的起始(UGCCCAUCC(u)U)和终止(AAU(1.2)CUUUUUU)序列。与经典的NDV毒株相比,NDV103株和NDV104株在NP基因和P基因之间的1644-1645nt处均有额外的6个碱基片段插入。其中NDV103株的插入序列为“CCCCCC”,而NDV104株的插入序列则为“TCTCAC”。各毒株基因组的两端序列的前48个碱基内互补现象严重,尤其是前12个碱基完全互补;P基因在484位均含有mRNA的编辑位点(UUUUUGG↓G)。   NDV103株和NDV104株的F基因全长均为1792bp,预计编码553个氨基酸组成的F蛋白,均含有保守的6个潜在糖基化位点,存在11个高度保守的半胱氨酸残基。此外,NDV103株比NDV104株在399位和514位有2个增加的半胱氨酸残基。   对NDV103和NDV104的F基因进行分析,F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸的序列分析结果显示该2株病毒符合强毒株的特征,这与毒力测定结果一致。F基因系统进化树显示,NDV103株属于基因Ⅸ型,与中国标准强毒株CH/F48E9/44位于同一分支;NDV104属于基因Ⅶ型,与CH/SF/02及CH/ZJ/00位于同一分支。结果表明这2株鸭源新城疫分离株在进化树中处于不同的进化分支。   NDV103株和NDV104株的HN蛋白长度均为571个氨基酸,均含有5个相对保守的潜在糖基化位点,但是分析结果显示NDV103株在538位还具有1个潜在糖基化位点,而NDV104株在该位点并不具备糖基化的特征。此外,2株病毒HN蛋白均存在13个完全保守的半胱氨酸残基位点。   NP基因全长1746nt或1747nt,预计编码389个氨基酸组成的NP蛋白。P基因全长均为1450nt,预计编码395个氨基酸组成的P蛋白。M基因的cDNA全长均为1711nt,预计编码364个氨基酸组成的M蛋白。L基因的cDNA全长均为6703nt,预计编码2204个氨基酸组成的L蛋白。   对NDV103株和NDV104株全基因组序列的生物信息学分析结果表明,各基因均有较高的保守性,NDV103株各基因均与鸡源毒株F48E8株、JS-1-97株和FJ-1-85株有较近的亲缘关系;而NDV104株各基因均与鸭源毒株SDWF02株有较近的亲缘关系。
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