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目的:研究中药连翘叶乙醇提取物体外对食管癌细胞株TE-13、TE-1、Yes-2和Eca-109增殖及对TE-13细胞凋亡的影响,为中药连翘用于食管癌的预防和治疗及进一步开发利用提供科学依据。
方法:
1.FSEE对不同食管癌细胞增殖的影响采用MTT法分析不同浓度(O.1、0.5、1、2、3、5mg/ml)连翘叶乙醇提取物(ethanol extract of Forsythia suspensa leaf, FSEE)作用于人食管癌细胞TE-13、TE-1、Yes-2和Eca-10924h后,及作用于TE-13细胞24、48、72h后对细胞增殖的抑制作用,从而选择适当的药物浓度和作用时间,以进行后继实验,探讨FSEE抑瘤机制。
2.FSEE对食管癌细胞形态的影响经2mg/ml FSEE作用于TE-13、TE-1、Yes-2和Eca-109细胞24h后,用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化。
3.FSEE对TE-13细胞形态的影响2mg/ml FSEE处理TE-13细胞24h,待细胞在盖玻片上贴壁良好后,继续培养24h,经瑞-姬染料(Wright-Giemsa)染色,倒置相差显微镜下观察细胞形态学改变。
4.FSEE对TE-13细胞凋亡率的影响2mg/ml FSEE作用于TE-13细胞24h后,经Annexin V/PI双染后用流式细胞术检测细胞凋亡率。
5.FSEE对TE-13细胞凋亡相关蛋白表达的影响用不同浓度(1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml)FSEE作用于TE-13细胞24h后,分析细胞PARP、caspase3、 caspase8、caspase9蛋白表达的变化。
6.FSEE对TE-13细胞凋亡相关基因表达的影响不同浓度(1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml) FSEE作用于TE-13细胞24h后,用半定量RT-PCR法检测Bcl-2家族中Bcl-2、Bcl-XL、Bax mRNA表达的变化。
结果:
1.MTT检测结果显示,不同浓度FSEE对TE-13、TE-1、Yes-2和 Eca-109细胞增殖反应均有显著抑制作用(P<0.05),并呈浓度依赖性,药物浓度越大,抑制效应越强。FSEE对TE-13细胞株抑制作用较为明显,当FSEE浓度为5mg/ml,作用72h时,对TE-13细胞增殖的抑制率达82.48%。
2.经显微镜观察发现,未经药物处理的TE-13、TE-1、Yes-2和Eca-109细胞呈贴壁生长,生长状态良好,细胞透明饱满、呈多边形,细胞间边界清楚;经2mg/ml FSEE处理24h后,呈漂浮状态生长的食管癌细胞数量明显增多,细胞变圆、固缩,存活细胞明显减少,但细胞膜并未溶解。
3.Giemsa染色观察,经2mg/ml FSEE作用TE-13细胞24h后,可诱导较典型的细胞凋亡形态学变化,如细胞形态发生皱缩变圆,体积缩小,胞浆浓缩,胞核向外呈锐角突起,核染色质固缩浓聚呈块状,边集于核膜下等,与对照组TE-13细胞的形态相比有明显变化。
4.流式细胞仪分析结果显示,不同浓度(0、1、2、5mg/ml)FSEE作用于TE-13细胞24h后,TE-13细胞凋亡率分别为0.74%、11.56%、25.10%和48.17%,凋亡率随药物浓度增加而明显增高,组间比较有显著性差异(P<0.01)。
5.经1、2和Smg/ml FSEE作用24h后,TE-13细胞PARP、caspase3、caspase9蛋白出现裂解片段,并随药物浓度增加,裂解片段浓度升高,呈浓度依赖性,组间比较有显著性差异(P<0.01)。
6.经1、2和5mg/ml FSEE作用24h后,用RT-PCR技术检测发现,FSEE上调了TE-13细胞Bax mRNA表达,下调了Bcl-2和Bcl-XL mRNA表达水平,组间比较有显著性差异(P<0.01)。
结论:
1.FSEE在体外可明显抑制TE-13、TE-1、Yes-2和Eca-109细胞的增殖,并呈浓度依赖性。
2.FSEE可诱导TE-13细胞凋亡,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,TE-13细胞凋亡率逐渐增加。
3.FSEE抗肿瘤机制可能与其通过caspase依赖性的内源途径诱导细胞凋亡有关。