猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)可引起母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道疾病。PRRSV在世界范围内流行,造成巨大的经济损失。抗体依赖的感染增强作用(ADE)是PRRSV的一个重要免疫学特征,同时也是PRRS防控中遇到的最大难题之一。PRRSV具有严格的细胞专嗜性,主要通过受体介导的胞吞作用感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)。TNF-α主要是由巨噬细胞产生的一种具有促炎活性和免疫调节作用的单核因子。核转录因子(NF-κB),作为信号转导途径中的枢纽,能够调节TNF-α等基因表达。NF-κB活化时,从胞浆易位到胞核,DNA结合活性提高,上调TNF-α等目标基因的转录。IKKβ是I-κB激酶的主要活性单位,参与NF-κB的活化过程。本研究用PRRSV BJ-4株经ADE途径体外感染PAM,分析了TNF-α、NF-κB及IKKβ的表达变化,探索PRRSV感染对猪肺泡巨噬细胞TNF-α的表达调控。分离培养PAM,采用标准的ADE测定方法确定PRRSV BJ-4株产生ADE的条件。用104 TCID50的PRRSV与等体积的10倍稀释后再以2的指数倍(2-1～2-8)稀释的阳性血清的混合物接种PAM,48h后收获病毒,用Marc-145细胞测定子代病毒活性。结果表明,1:320稀释的抗PRRSV抗体能显著增强PRRSV BJ-4株的繁殖(p<0.5)。用RT-PCR技术从PAM cDNA中扩增了TNF-α、NF-κB、IKKβ及β-actin部分基因片段,回收纯化PCR产物,连接PMD19-T载体,转化宿主菌JM109,提取质粒DNA,得到重组标准品质粒。对重组标准品质粒进行PCR和测序鉴定,表明成功克隆了目的片段。系列梯度稀释重组标准品质粒,进行SYBR Green-I荧光定量PCR,Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系,建立了TNF-α及NF-κB、IKKB的SYBR Green-I荧光定量PCR检测方法。PRRSV BJ-4株分别经ADE途径和正常途径感染猪肺泡巨噬细胞,24 h后收集细胞和培养上清。利用SYBR Green-I荧光定量PCR检测TNF-α、NF-κB和IKKβ的mRNA表达变化。同时,采用定量ELISA检测猪肺泡巨噬细胞培养上清中TNF-α的蛋白浓度。试验结果表明,PRRSV经ADE途径感染的猪肺泡巨噬细胞TNF-α表达下调,NF-κB和IKKβ也同时表达下调。对PAM培养上清中TNF-α的蛋白检测结果表明,TNF-α的蛋白表达变化与mRNA的表达变化基本一致。