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[目的]在分子水平上基于JNK信号通路探讨庆大霉素所致耳肾毒性的病理机制,阐述川芎嗪对庆大霉素耳肾毒性的防治作用,进一步丰富中医肾主耳理论基础及内在的本质。[方法]筛选健康、耳廓反射正常的白毛红目豚鼠48只,适应性喂养1周后随机分成4组:第一组庆大霉素(GM)造模组、川芎嗪干预(GM+TMP)组、川芎嗪(TMP)组和空白对照(NC)组,每组12只。GM组:肌注硫酸庆大霉素120mg·kg-1·d-1;GM+TMP组:肌注硫酸庆大霉素120 mg·kg-1·d-1及腹腔注射盐酸川芎嗪30mg·kg-1·d-1;TMP组:腹腔注射盐酸川芎嗪30mg.kg-1.d-1;空白对照组:肌注与GM组等量的生理盐水。每日根据体重调整给药剂量,所有组豚鼠均连续给药13天,每组豚鼠首次用药前1天及用药13天后均行客观听力测试,采用click ABR阈值测试来判断各实验组豚鼠的听力情况。测试结束后对各组豚鼠取血检测尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)水平,实验结束后所有豚鼠断头处死,收集耳蜗和肾脏组织,进行HE染色,在光镜下观察耳蜗和肾脏的病理变化。应用Western blot法检测耳蜗、肾脏组织JNK蛋白表达量,并进行相关性分析。[结果]1.听力检查结果:见表2、图1,实验结果示各组豚鼠用药前听阈无显著性差异(P>0.05)。用药后GM组的click ABR阈值显著性升高(54.64±23.72 dB nHL),听力比空白对照组(8.17±5.33 dB nHL)有所下降,差异具有统计学意义(P<0.05);GM+TMP 组的 click ABR 阈值(28.17±26.54 dB nHL)虽有升高,听力依然较空白对照组差,差异具有统计学意义(P<0.05),但比GM组低,差异具有统计学意义(P<0.05):TMP组的click ABR阈值(7.83±4.49 dB nHL)与空白对照组相比,听力差异无统计学意义(P>0.05)。2.肾功能检测结果:见表3,图2,用药后GM组血清BUN、SCr值显著性升高,与空白对照组相比,差异具有统计学意义(p<0.05);用药后GM+TMP组血清BUN、SCr显著下降,与用药后GM组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),与空白对照组的血清BUN、SCr含量相比,差异不具有统计学意义(p>0.05)。TMP组的血清BUN、SCr值与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。3.形态学检查结果:见附图23.1 GM组可见耳蜗Corti器毛细胞减少,有较多缺失,呈现水肿状态,螺旋神经节细胞间隙增大,有空泡变性;GM+TMP组耳蜗Corti器毛细胞散在缺失,呈现空泡状,螺旋神经节细胞形态结构有不同程度病理改变,细胞数量有所减少,但较造模组损伤轻;TMP组和空白对照组耳蜗Corti器毛细胞及螺旋神经节细胞形态正常,细胞排列相对密集;3.2 GM组可见肾小球萎缩,肾小管出现炎症细胞浸润、排列不规则,细胞肿胀、变性坏死,肾间质出血;GM+TMP组肾脏小管上皮细胞出现轻微肿胀、变性;TMP组和空白对照组肾脏小管、肾小球、间质无特殊性改变;4.Western blot法检测结果4.1耳蜗JNK蛋白表达:用药后GM组JNK2、p-JNK2蛋白表达量及与GM+TMP组、空白对照组相比,均具有统计学差异(P<0.05),JNK2、p-JNK2蛋白表达量增加;GM+TMP组JNK2、p-JNK2蛋白表达量与空白对照组相比,不具有统计学差异(P>0.05);TMP组JNK2、p-JNK2蛋白表达量与空白对照组相比,不具有统计学差异(P>0.05),提示川芎嗪可抑制JNK2蛋白的表达,抑制JNK2的磷酸化;且用药后各组间JNK1、p-JNK1蛋白表达量之间比较均无统计学意义(P>0.05);表明了 JNK2蛋白在GM致聋和TMP抑制中起到了关键性作用。且豚鼠耳蜗JNK2、p-JNK2蛋白表达量与click ABR阈值具有明显的线性相关趋势(r=0.83,r=0.92,P<0.05)。4.2肾脏JNK蛋白表达:用药后GM组JNK2蛋白表达量与GM+TMP组、TMP组、空白对照组相比,均具有统计学差异(P<0.05),JNK2表达量增加;GM+TMP组JNK2蛋白表达量与TMP组、空白对照组相比,均具有统计学差异(P<0.05),JNK2表达量增加,且小于GM组的表达量;TMP组蛋白表达量与空白对照组相比,不具有统计学差异(P>0.05)。提示川芎嗪可抑制JNK2蛋白的表达;GM组和GM+TMP组的JNK1蛋白表达量与空白组以及TMP组相比,均具有统计学意义(P<0.05),GM组和GM+TMP组的JNK1表达量减小。且豚鼠肾脏JNK2蛋白表达量与血清BUN、SCr值具有明显的线性相关趋势(r=0.83,r=0.77,P<0.05)。5.耳肾JNK蛋白表达量的相关性分析:耳、肾在JNK2和总JNK蛋白表达水平上呈正相关(r=0.74,r=0.71),具备明显的线性相关趋势(p<0.05)。且耳、肾在JNK1蛋白表达水平上无相关性,不具备直线相关趋势(p>0.05)。提示JNK2可能作为耳肾互相关联的分子信号基础。[结论]1.给豚鼠肌注射硫酸庆大霉素,可建立耳聋和肾功能损伤的模型,JNK信号通路可能反映了庆大霉素所致耳肾功能损害程度的重要因子之一,JNK信号通路激活,大量JNK蛋白表达。2.川芎嗪可有效防治庆大霉素的耳肾毒性作用,保护听力和肾功能,川芎嗪可能通过JNK信号通路干预庆大霉素所致耳肾功能的损害程度,JNK信号通路被抑制,JNK蛋白表达量降低。3.本实验中耳肾具有相同的病理及干预过程,JNK信号通路可能是耳肾互相关联的指标之一,特别是JNK2蛋白,可能是中医“肾主耳”的分子基础之一。