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第一部分:2型糖尿病患者胃排空速率的种族差异及肠道激素分泌特征背景和目的:胃排空是调控餐后血糖的重要动力学因素,虽然胃排空速率相对稳定,但个体间差异巨大。食物通过胃排空进入小肠后,可刺激肠道内分泌细胞分泌一系列肠道激素。其中,胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide,GIP)统称为肠促胰岛素,共同介导餐后葡萄糖代谢及食欲调控。因此,明确2型糖尿病状态下胃排空速率及肠道激素分泌特征,对基于胃肠道的2型糖尿病防治具有重要临床意义。2型糖尿病的病理生理存在较大的人种差异。现有文献报道了胰岛素分泌受损、高碳水化合物后血糖波动情况以及DPP-4(dipeptidyl peptidase 4)抑制剂疗效在种族间的差异,但缺乏胃排空及餐后血糖波动在不同种族间的比较性研究。此外,肠促胰岛素在不同营养成分及胃排空速率下分泌的模式尚无系统描述。因此,该博士论文的第一部分研究工作着重明确:1)健康受试者及2型糖尿病患者十二指肠内葡萄糖和蛋白质定量灌注诱导的GLP-1和GIP分泌模式;2)汉族及高加索2型糖尿病患者胃排空速率及餐后血糖差异。研究方法:1、研究一整合了本中心既往研究中健康受试者及2型糖尿病患者十二指肠内灌注葡萄糖(0、1、2、3、4 kcal/min)及蛋白质(乳清蛋白,0、0.5、1.5 kcal/min)所诱导的GLP-1和GIP原始数据,基于最大似然混合效应模型、似然比检验等多种方法评价GLP-1和GIP增量曲线下面积,在不同营养成分及灌注速率下的分泌模式以及健康与2型糖尿病受试者间的差异。2、研究二纳入了汉族及高加索2型糖尿病患者各14名。入组患者均通过生活方式干预和/或二甲双胍控制血糖,并于隔夜禁食后进食同位素锝99标记的标准土豆泥餐(368.5 kcal:含61.4 g碳水化合物,7.4 g蛋白质和8.9g脂肪)。餐后胃排空通过同位素记录仪进行连续记录。餐后血糖在固定时间点评估。研究结果:1、十二指肠内低速率灌注葡萄糖或蛋白质即可有效刺激GIP分泌,而葡萄糖或蛋白质灌注速率需达到1.5-2kcal/min方可有效刺激GLP-1分泌。与葡萄糖相比,不同灌注速率下蛋白质诱导的GIP分泌水平并无差异,但其在低速率灌注时的促GLP-1分泌作用更加显著(似然比检验结果:GLP-1:似然比=8.68,自由度=3,P=0.0339;GIP:似然比=1.54,自由度=3,P=0.6734)。此外,健康与2型糖尿病受试者在十二指肠内定量葡萄糖灌注下的GLP-1和GIP分泌模式无显著差异。2、两组受试者糖化血红蛋白无显著差异(汉族:6.8±0.2%vs.高加索:6.4±0.2%)。与高加索患者相比,汉族患者胃排空速率更快(胃半排空时间T50:汉族:56.8±3.7 min vs.高加索:71.1±4.3 min,P<0.05),餐后血糖增量更高(汉族:8.5±1.0 mmol/L vs高加索:6.3±0.6 mmol/L,P<0.05)。T50与餐后60min血糖增量(r=-0.43,P<0.05)及餐后血糖峰值(r=-0.40,P<0.05)均呈负相关。结论:1、肠道激素分泌与肠内营养负荷及种类密切相关:其中GIP的分泌反应较为灵敏,低速率营养负荷即可显著刺激GIP分泌,而GLP-1则需较高速率的营养负荷。低速率灌注情况下,蛋白质较葡萄糖具有更强的促GLP-1分泌作用,但在高速率肠内灌注时,两者对GLP-1最大促泌作用相似。此外,2型糖尿病状态未影响肠内营养的促GLP-1和GIP分泌作用;2、汉族2型糖尿病患者较高加索患者胃排空速率更快,且餐后血糖波动幅度也更加明显,因此,延缓胃排空可能对其餐后血糖调控更加重要。第二部分:肠道苦味受体、胆汁酸对肠道激素及餐后血糖的影响背景和目的:最新研究发现,胃肠道黏膜表面存在丰富的味觉感受器,可感知胃肠道内容物的味觉信号。激动相关受体可介导肠道激素分泌,进而调控胃肠道运动、食欲及餐后血糖。动物研究提示肠内苦味受体信号可通过上述途径显著改善葡萄糖代谢及减重,而苦味受体在人体肠道不同区域的表达水平(尤其与肠道内分泌系统的共表达)尚无系统研究。苦味受体激动剂在临床水平对肠道激素分泌、能量摄入和血糖的影响亦不明确。胆汁酸是肠道内重要的生物活性物质,也是具有苦味属性的信号分子,广泛参与了人体血糖、血脂及能量代谢调节。2型糖尿病的进展是否与胆汁酸代谢异常相关仍不明确。因此,该博士论文的第二部分着重围绕肠道苦味受体及胆汁酸开展了如下研究:1)鉴定苦味受体在人体肠道内的分布、与肠道L细胞的共表达,以及其促肠道激素分泌的作用;2)评估不同剂量苦味受体激动剂对肠道激素及血糖等的影响;3)探索不同肠道区域苦味信号刺激对肠道激素、能量摄入及血糖的影响;4)比较健康及新诊断2型糖尿病患者胆汁酸谱的差异。研究方法:1、研究一在组织水平鉴定了不同苦味受体亚型在不同区域肠道组织中的表达水平及促肠道激素分泌的作用:(1)苦味受体在肠道黏膜组织中的表达:分别选取课题组肠道组织样本库中健康受试者十二指肠、回肠、右结肠和直肠样本组织、2型糖尿病患者十二指肠的样本组织以及健康受试者十二指肠组织的冰冻切片,通过PCR和免疫荧光等方法,明确苦味受体在肠道内的区域性表达情况及其与L细胞的共表达情况。(2)苦味受体促肠道激素的体外研究:分离小鼠空肠和回肠组织,加入不同浓度苦味受体激动剂苯酸苄铵酰铵(denatonium benzoate,DB),共同孵育后检测上清活性GLP-1浓度。2、研究二共纳入16名健康受试者,评价十二指肠内灌注苦味受体激动剂DB对肠道激素、血糖及能量摄入的影响。入组后,受试者随机接受3次十二指肠灌注(间隔至少7天):1)对照(水);2)低剂量DB(10mg DB);3)高剂量DB(30mg DB)。每次访视,受试者空腹过夜后次晨抵达研究中心,通过鼻腔插管至十二指肠,给予上述干预(t=0-150min),并在t=60-150min期间,同时以2kcal/min的速度向十二指肠输注葡萄糖。输注结束后予受试者30min内进食标准自助餐以评估能量摄入情况。胃肠道激素及血糖水平通过每隔15min采集受试者血样本评估。3、研究三共纳入16名健康受试者,评价十二指肠及回肠灌注DB对肠道激素、血糖及能量摄入的影响。入组后,受试者随机接受3次肠道靶向灌注(间隔至少7天):1)对照(十二指肠水+回肠水);2)十二指肠DB刺激(十二指肠30mg DB+回肠水);3)回肠DB刺激(十二指肠水+回肠30mg DB)。每次访视,受试者空腹过夜后次晨抵达研究中心,通过鼻腔插管至幽门下190厘米,进行上述干预(t=0-60min)。输注结束后予受试者30min内进食标准自助餐以评估能量摄入情况。胃肠道激素及血糖水平通过每隔15min采集受试者血样本评估。4、研究四共纳入40名健康受试者及40名2型糖尿病患者,比较两组人群胆汁酸谱的差异。所有受试者口服75克葡萄糖溶液(75 g oral glucose tolerance test,OGTT),并在空腹及2小时后收集血样本以检测胆汁酸谱(包括CA、CDCA、DCA、GCA、GCDCA、GDCA、TCA、TCDCA和TDCA)、血糖、胰岛素、GLP-1和成纤维细胞生长因子19(fibroblast growth factor 19,FGF19)水平。此外,受试者的空腹血样本还用于检测胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平。正态分布数据表示为平均值±标准误。非正态分布数据以中位数和四分位数范围(25-75百分位)表示。研究结果:1、(1)T2R3、4、5、9、38、10、14、20和46在人体肠道各区域均有表达,健康受试者回肠T2R3、4、5和14表达最丰富,2型糖尿病患者十二指肠苦味受体表达与健康受试者无显著差异。十二指肠T2R3、4、5、14、46受体均与L细胞存在共表达。(2)DB可剂量依赖性刺激小鼠空肠(高浓度DB较对照组可刺激约5倍的GLP-1分泌,P<0.001)与回肠GLP-1分泌(高浓度DB较对照组可刺激约7倍的GLP-1分泌,P<0.001)。2、受试者十二指肠葡萄糖负荷时,灌注DB可升高总GLP-1的增量曲线下面积(iAUC,对照:39.0±169.6 pmol/L*min vs 10mg DB:95.3±110.7 pmol/L*min vs 30mg DB:442.7±133.4 pmol/L*min,P<0.05),降低血浆胃饥饿素的iAUC(对照:13.6±157.8 pg/mL*min vs 10mg DB:-283.9±91.34 pg/mL*min vs 30mg DB:-719.1±169.8 pg/mL*min,P<0.05),并减少了受试者能量摄入(对照:4969±270.5 KJ;10mg DB:4677±281.3 KJ;30mg DB:3979±315.4 KJ,P<0.05),其中30mg DB与水相比,GLP-1、胃饥饿素和能量摄入具有显著性差异(P<0.05)。血浆葡萄糖、胰岛素、胰高血糖素及PYY水平在不同干预中未有明显差异。3、与对照相比,十二指肠或回肠单纯灌注苦味受体激动剂DB对健康受试者血糖(iAUC0-90min,对照:35.7±7.3 mmol/L*min;十二指肠DB:31.1±5.7mmol/L*min;回肠DB:29.8±7.4 mmol/L*min)、GLP-1(iAUC0-90min对照:308.8±61.7 pmol/L*min;十二指肠DB:253.6±64.5 pmol/L*min;回肠DB:319.7±68.8 pmol/L*min)、PYY(iAUC0-90min对照:119.5±42.0 pmol/L*min;十二指肠DB:88.0±34.0 pmol/L*min;回肠DB:150.1±40.7 pmol/L*min)和能量摄入(对照:4854±463.3 KJ;十二指肠DB:5040±492.1 KJ;回肠DB:4740±438.3 KJ)均无显著影响。4、2型糖尿病患者糖化血红蛋白(Hb A1c)、空腹及OGTT 2小时后血糖均高于健康受试者(P<0.05)。2型糖尿病患者空腹及OGTT 2小时后血清胰岛素水平均高于健康受试者(P=0.001和P=0.004)。空腹状态下,健康及2型糖尿病患者的GLP-1水平无显著差异(健康受试者:28.74(13.41,46.67)pmol/L vs 2型糖尿病患者:27.97(22.45,32.51)pmol/L),在OGTT 2小时后,新诊断2型糖尿病患者的GLP-1升高幅度要低于健康受试者(健康受试者:60.93(55.57,68.42)pmol/L vs 2型糖尿病患者:45.11(31.73,61.18)pmol/L,P=0.012)。两组受试者空腹及OGTT 2小时后的血清FGF19水平未见明显差异。健康受试者OGTT 2小时后总胆汁酸水平较空腹升高(605.7(362.4,887.4)ng/mL vs 757.0(442.9,1376.9)ng/mL),而新诊断2型糖尿病患者总胆汁酸水平在OGTT 2小时后较空腹状态轻幅下降(717.0(408.6,1304.8)ng/mL vs 749.1(451.2,900.0)ng/mL)。在健康受试者中,OGTT 2小时后的血清总胆汁酸水平与OGTT 2小时后的血糖(r=-0.42,P=0.0063)以及甘油三酯(r=-0.40,P=0.0114)水平均呈负相关,而与FGF19(r=0.42,P=0.0057)以及高密度脂蛋白(r=0.50,P=0.0009)水平呈正相关。结论:1、苦味受体在人体肠道各区域广泛表达,并与肠道L细胞存在共表达。肠道苦味受体在健康与2型糖尿病状态下的表达水平无显著差异。苦味受体激动剂可有效刺激小鼠空肠和回肠GLP-1分泌。该系列研究发现为基于肠道苦味受体的降糖治疗提供了理论依据。2、健康受试者在十二指肠内葡萄糖灌注时,十二指肠内DB可增加GLP-1分泌,抑制胃饥饿素分泌及能量摄入,但不影响PYY、血糖、胰岛素和胰高血糖素水平。这为今后进一步探讨基于肠道苦味受体的肥胖及2型糖尿病治疗方案提供了临床实验依据。3、健康受试者十二指肠或回肠内靶向灌注苦味受体激动剂,未能影响其血糖、肠道激素分泌及能量摄入。4、与健康受试者相比,2型糖尿病患者口服葡萄糖后胆汁酸反应受损。在健康状态下,口服葡萄糖后胆汁酸水平与血糖水平及胆汁酸水平负相关,而与FGF19以及高密度脂蛋白水平呈正相关,提示OGTT前后胆汁酸谱的变化或许可预测2型糖尿病的发生。