论文部分内容阅读
目的:大剂量的水杨酸钠可以对从耳蜗到中枢神经的不同听觉系统层次造成听觉损害,尤其损伤耳蜗螺旋神经节,造成耳鸣、听力下降和言语认知能力减低。最新研究发现神经炎症是水杨酸钠诱导听觉损伤的新机制,水杨酸钠会导致耳蜗中多种炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-1上调。而炎症小体可能是SGN细胞中炎症因子上调的原因,尽管它们是否确实参与了耳鸣的发展尚不清楚。而NLRP3作为ROS的传感蛋白,可能有助于炎症小体组装以及导致随后的耳蜗炎症。那么充当NLRP3阻滞剂的药物就可能代表了治疗耳鸣的创新策略。我们通过研究炎症复合体及其相关通路在大鼠耳蜗中的激活,探讨水杨酸钠诱导SGN损伤的关键分子机制,为SS可能引发的耳鸣提供预防和治疗新方向。方法:本研究采用SD大鼠为研究对象,将64只大鼠随机分为4组:对照（Control）组、人工外淋巴液（APL）组、水杨酸钠（SS）组和NLRP3拮抗剂（SS+MCC950）组。对照组腹腔注射等量生理盐水;APL组用人工外淋巴液代替MCC950圆窗给药;SS组腹腔注射水杨酸钠7天之前先经圆窗人工外淋巴液给药;SS+MCC950组在腹腔注射水杨酸钠之前先经圆窗给药MCC950做预处理,用NLRP3不可逆抑制剂（MCC950）直接阻断NLRP3炎性小体形成,在上游作用于NLRP3信号通路。我们通过ABR、DPOAE等电生理方法检测造模前后的动物以确认听觉损害程度;利用HE染色等形态学方法观察耳蜗SGN的病理生理改变;采用实时荧光定量PCR对各组大鼠耳蜗组织中炎症复合体相关及炎性相关因子的表达水平进行检测;最后采用免疫组化评估水杨酸钠诱导耳蜗炎症复合体及相关炎性因子的蛋白表达水平及在耳蜗中的定位。结果:给药前大鼠的ABR平均听阈为31.79±4.13 d B SPL,造模第7天Control组动物ABR阈值为32.5（26.25,35）d B SPL、APL组为32.5（30,35）d B SPL、而SS组ABR阈值提高到50（45,55）d B SPL、SS+MCC955组则为40（35,40）d B SPL。通过DPOAE检测,各组在低频2k Hz频率下,各组间均无差异（P>0.05）;在4k Hz、6k Hz、8k Hz频率刺激下,control组与APL组间DP幅值无明显差异（P>0.05）,SS组大鼠较control组和APL组DP幅值均显著下降（P<0.001,P<0.05,P<0.001）,,提示大剂量水杨酸钠给药造成了大鼠耳蜗损伤。SS+MCC950组经MCC950（NLRP3抑制剂）预处理后在3k Hz、4k Hz、8k Hz、10k Hz频率下同SS组差异显著（P<0.001）,达到与control组及APL组相比无明显差异的效果。通过HE染色观察大剂量注射水杨酸钠造成的SGN损伤,我们观察到control组和APL组耳蜗结构正常;而SS组和SS+MCC950组则出现不同程度的耳蜗SGN细胞变形,移位,界限不清,部分溶解消失,胞体明显缩小,胞核染色质边集、核固缩、核溶解,具有细胞死亡特征。对SGN细胞的损伤情况进行定量分析,我们发现与control组和APL组相比,SS组的SGN损伤变化显著（P<0.001,P<0.001）;经MCC950预处理的SGN损伤情况较SS组明显改善（P0.05）。免疫荧光定量PCR的结果经过计算得到（1）NLRP3 m RNA的各组△CT表达量分别为:control组7.438±0.483,APL组7.254±0.848,SS组5.41±0.622,SS+MCC950组6.378±0.479;（2）Caspase-1 m RNA的各组△CT表达量分别为:control组6.811±0.05,APL组6.76±0.401,SS组4.035±0.26,SS+MCC950组5.602±0.157;（3）IL-1βm RNA的各组△CT表达量分别为:control组8.547±0.157,APL组8.363±0.375,SS组5.831±0.059,SS+MCC950组7.271±0.296。而免疫组化结果显示三种蛋白在control组和APL组SGN区域表达量很少,呈弱阳性表达;SS组大量SNG细胞胞质中呈现大量深棕黄色颗粒,呈强阳性表达;SS+MCC950组中SNG区域目的蛋白的表达介于上述二者之间,呈阳性表达。在这项研究中,rt-PCR和免疫组化互相印证,证明了在水杨酸钠诱导的大鼠听觉损伤模型中,SNG区域中的NLRP3,IL-1β和caspase-1的转录表达水平显著增加,具有神经毒性,导致听力受损,并且这些因子的增加可能进一步上调其他炎症因子的表达。而MCC950预处理明显减弱了这一作用。通过电生理检查和形态学观测,我们发现NLRP3抑制剂MCC950可有效地抵消与耳鸣相关的SGN病理生理学改变。结论:基于动物实验,我们发现未激活时NLRP3在SGN细胞内的表达量很低,水杨酸钠给药处理后NLRP3,caspase-1,IL-1β的m RNA转录水平被显著放大在大鼠损伤的SGN区域,而NLRP3抑制剂MCC950可降低NLRP3及其下游caspase-1,IL-1β的表达,并有效地抵消与耳鸣相关的SGN病理生理学改变。我们的结果揭示了水杨酸钠耳毒性可能涉及引发NLRP炎性小体激活,这是一种新型的炎症免疫机制,水杨酸钠能够激活耳蜗内NLRP3受体介导的炎症复合体,这个过程中可能存在NLRP3炎症小体信号转导通路,通过NLRP3-ASC-caspase-1途径促进IL-1β大量释放,并可能间接促进其他多种炎症因子上调,加剧耳蜗内炎症反应,导致耳蜗内重要结构SGN的损伤,这一机制可能也是水杨酸钠引起耳鸣的重要原因。此外,我们证明了NLRP3特异性抑制剂MCC950可改善SS诱导的听觉损伤,直接抑制NLRP3是治疗SS诱导听觉损伤的新靶标。总之,炎性小体的激活引发的炎症在水杨酸钠诱导听觉损害的病理过程中起着重要作用,并且可能参与耳鸣的复杂发病机制。而MCC950是NLRP3特异性抑制剂,可改善水杨酸钠给药大鼠的听觉损伤程度。直接抑制NLRP3或许可能是治疗耳鸣的合适策略。另外NLRP3炎症小体信号通路可以引发细胞焦亡,结合HE染色观测到的细胞死亡情况,我们推测NLRP3炎症小体激活引发的细胞焦亡程序可能也参与水杨酸钠诱导SGN损伤机制,而这需要后续研究以待证实。