花粉是高等植物父方遗传物质的载体,对植物繁殖后代和创造遗传多样性至关重要。花粉壁是包裹在花粉外围的多层结构,它保护植物的雄配子体免受各种生物和非生物胁迫的影响,并在花粉识别和萌发中发挥重要作用。植物发育形成独特的花粉壁结构和精巧的外壁模式的过程精细而复杂,需要生殖细胞和相邻体细胞的高度协同调控。然而,这一过程的分子机制仍不明朗。脂质转运蛋白（lipid transfer protein,LTP）是一类具有分泌型信号肽的小分子碱性蛋白,广泛参与植物生物学的各个过程,也在花粉发育中起着关键作用。因此,深入研究LTP的功能及其调控途径,对于完善和阐明植物花粉发育的调控网络具有重要意义。在本研究中,我们鉴定了一份水稻雄性不育突变体lipid transfer protein-like 94（l94）,并通过遗传学、细胞学和生物化学等手段证实了编码分泌型LTP的OsLTPL94在水稻花粉发育中起关键作用。另外,我们进一步发现碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix,b HLH）转录因子ETERNAL TAPETUM 1（EAT1）能够结合OsLTPL94启动子并激活其表达,提示OsLTPL94可能作为EAT1的直接下游靶标参与水稻花粉发育。主要研究结果如下:1.通过甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate,EMS）诱变创制了l94突变体,遗传分析表明其雄性不育表型是单基因隐性突变引起的。进一步细胞学观察发现,l94的小孢子初生外壁形态不规则,随后无法形成正常的花粉外壁模式,小孢子在第10期之后明显皱缩、破裂;同时,l94绒毡层的退化也不正常,其表面乌氏体较小且分布杂乱。与之相符,一些绒毡层或花粉壁发育关键基因的表达也在l94中发生了明显改变。这些结果显示l94的花粉败育可能是初生外壁的异常模式影响了孢粉素的正确沉积和组装所致。2.Mut Map分析发现了两个位于3号染色体上的候选基因,进一步利用CRISPR/Cas9技术证实,只有LOC＿Os03g46110基因的敲除株系出现与l94相似的细胞学异常和雄性不育表型。l94中该基因第一外显子上的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism,SNP）导致了氨基酸的错义突变,遗传分析显示该突变位点与雄性不育表型共分离。这些结果表明LOC＿Os03g46110基因即为OsLTPL94。3.qRT-PCR分析表明OsLTPL94在水稻花药发育的第6–8期表达量最高,进一步β-glucuronidase（GUS）染色和RNA原位杂交分析显示,OsLTPL94主要在减数分裂时期的绒毡层和小孢子中表达,这些结果支持OsLTPL94在花粉和绒毡层发育中发挥功能。4.系统发育分析表明,OsLTPL94编码一个可能在禾本科植物中功能保守的G型LTP。亚细胞定位显示,OsLTPL94蛋白特异地定位于细胞膜,而l94的突变位于其N端的信号肽区域,突变后蛋白的质膜特异性定位被削弱。进一步结合烟草瞬时表达和酵母分泌试验证实,OsLTPL94的信号肽具有分泌能力,l94的花粉败育可能由于OsLTPL94的分泌受到了阻碍。此外,蛋白截短试验表明OsLTPL94的质膜定位也需要其C端的糖基磷脂酰基醇锚（glycosylphosphatidylinositol-anchor,GPI-anchor）来维持。5.脂质相关基因往往受到许多转录因子的直接调控。我们通过体内和体外试验证实,b HLH转录因子EAT1能结合OsLTPL94启动子区域的E-box基序激活其表达,提示在水稻花粉发育中OsLTPL94可能作用于EAT1的下游。随后,我们分别鉴定到两个独立的eat1的等位突变体,它们都表现出与l94密切相关的花粉壁和绒毡层发育异常。eat1-5中EAT1的转录能力有缺陷,而OsLTPL94的表达也显著下调;eat1-6中的EAT1蛋白仍具有转录激活活性,而其中EAT1和OsLTPL94的表达亦呈正相关。这些结果均支持OsLTPL94可能是EAT1的直接下游靶标。综上,本研究证实了一个编码分泌型LTP的基因OsLTPL94是水稻花粉发育所必须的,并提出“EAT1-OsLTPL94”模块可能在绒毡层和小孢子的协调发育中起关键作用,为水稻花粉发育调控机制提供了有价值的新信息。