论文部分内容阅读
养猪生产中有15%-20%的新生仔猪是宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)个体。IUGR的发生及其带来的不利影响严重制约了我国养猪业的发展。非编码RNA(noncoding RNA,nc RNA)作为一类表观遗传调控因子,是遗传对环境因子的响应调控方式,针对nc RNA的研究有助于加深对猪IUGR产生和IUGR猪差异特征形成的理解,并为改善猪IUGR的产生和提高IUGR猪生产性能提供参考。本研究系统分析了猪场IUGR发生的影响因素及IUGR猪与正常猪生产性能差异和骨骼肌氨基酸代谢特征;同时,以miRNA为主要研究对象重点关注了miRNA在正常和IUGR猪骨骼肌不同发育阶段的表达特征,以生后35 d(恢复断奶应激,育肥前期)为重要阶段探索了不同nc RNA的表达特征和调控网络;并针对关键调控因子开展功能验证和可行性的应用探索。主要研究结果如下:1.遗传力评估结果显示影响猪IUGR发生的关键指示性指标(产仔数、弱仔数、窝重、窝均重),均属于低遗传力性状。基于猪场生产数据的分析,发现配种组合、分娩胎次、妊娠天数、公猪等级和性别是影响仔猪出生重的重要影响因素,而分娩季节对仔猪初生重无显著影响。2.IUGR猪和正常猪生长曲线拟合显示Gompertz为最佳拟合模型,IUGR猪相较于正常猪最大日增重减少141.67 g。180日龄屠宰时IUGR猪体重较正常猪降低21.12kg,同时胴体长、肩部背膘厚、眼肌面积均显著低于正常猪。在肉质性状方面,滴水损失、24 h内p H下降速率均显著高于正常猪,熟肉率、肌内脂肪含量(intramuscular fat,IMF)、L1*和a1*值均显著低于正常猪。3.基于靶向代谢组的骨骼肌氨基酸分析显示:不同阶段(新生(1 d)、生后35d和180 d)猪骨骼肌中各氨基酸的内部相关性特征不同。但支链氨基酸(branched chain amino acids,BCAA)在3个阶段中均相互呈正相关关系,MET、PHE、THR、TRP、TYR和ARG之间也相互正相关,而GLN与支链氨基酸均存在负相关关系。4.m RNA测序分析显示:与正常猪相比新生阶段IUGR猪骨骼肌上调886个基因,下调1005个基因;生后35 d阶段IUGR猪骨骼肌中上调874个基因,下调625个基因。分析公共数据(GSE169092)发现胚胎63天IUGR猪骨骼肌中上调1743个基因,下调375个基因。3个阶段差异基因共同显著富集到muscle tissue development和striated muscle tissue development等12个生物学过程以及PI3K-AKT signaling pathway和Protein digestion and absorption等9条信号通路。5.胚胎90 d、新生(1 d)、生后35 d、生后180 d和胚胎63 d(公共数据,GSE169093)的背最长肌miRNA测序显示:在胚胎63 d猪骨骼肌中,IUGR猪肌肉上调15个,下调9个。在胚胎90 d猪骨骼肌中,IUGR猪上调43个,下调63个。在生后1 d猪骨骼肌中,IUGR猪上调16个,下调22个。在生后35 d猪骨骼肌中,IUGR猪上调55个,下调32个。在生后180 d猪骨骼肌中,IUGR猪上调124个,下调57个。差异miRNA在胚胎63 d主要涉及细胞对刺激的反应(尤其是对饥饿的反应),在胚胎90d主要涉及蛋白质分解代谢过程,新生阶段主要涉及纤维和蛋白聚合过程,生后35 d主要涉及转录调控过程,180 d时主要涉及脂质代谢和自噬相关过程。6.针对35 d猪骨骼肌t RNA来源的小片段(t RNA-derived small RNA,ts RNA)分析,共鉴定到586个ts RNA,猪骨骼肌中主要高表达t RF-5c类型ts RNA。差异分析显示19个ts RNA在IUGR中下调,9个在IUGR中上调,功能富集分析显示高表达ts RNA主要涉及胚胎发育过程,差异表达ts RNA主要细胞内信号转导和蛋白质磷酸化等过程。差异ts RNA主要富集到m TOR、AMPK等信号通路。7.在35 d正常和IUGR猪骨骼肌中共鉴定到8367个lnc RNA,IUGR猪中上调208个,下调131个;共鉴定到24047个circ RNA,其中IUGR猪骨骼肌中上调152个,下调117个。正常和IUGR猪骨骼肌差异lnc RNA主要涉及核苷酸代谢和稳态过程,差异circ RNA主要涉及骨骼肌功能和物质转运过程。8.基于胚胎至新生阶段骨骼肌和脐带血外泌体的差异miRNA和m RNA分析,初步构建了:脐带血外泌体→miR-29家族→IGF1/CCND1→细胞增殖和蛋白质降解的调控通路。基于生后阶段表型特征和多种转录组分析,发现肌肉萎缩是IUGR猪骨骼肌的普遍特征,miR-222在多种肌肉萎缩模型均高表达,同时染料木素被发现可作为miR-222天然调控剂用于缓解肌肉萎缩。针对IUGR猪肉质特征,分析发现miR-152→PKM(丙酮酸激酶)→乳酸通路可能是影响IUGR猪肌肉p H迅速下降的主要通路。对ts RNA和氨基酸的共分析发现,ts RNA的产生可能会影响宿主t RNA对相应氨基酸的转运能力,造成氨基酸代谢异常,同时以t RF-Glu-TTC-047为特征性ts RNA初步证实t RF-Glu-TTC-047通过IGF1调控IUGR猪骨骼肌发育过程。综上所述,本研究分析了猪场影响IUGR猪发生的因素以及IUGR猪与正常猪生产性能和骨骼肌氨基酸代谢差异,构建了猪骨骼肌发育重要阶段(初级肌纤维形成、次级肌纤维形成、新生、育肥早期至屠宰)正常和IUGR猪差异miRNA表达特征库,首次绘制了正常和IUGR猪骨骼肌ts RNA表达谱,分析了正常和IUGR猪lnc RNA和circ RNA表达特征信息,鉴定并初步验证了miR-29家族、miR-222、miR-152以及t RF-Glu-TTC-047为代表性nc RNA对猪骨骼肌发育的调控。同时,以这些关键nc RNA为基础,初步探索了甘氨酸(Gly)、谷氨酰胺(Gln)和染料木素等功能性小分子对相关nc RNA的调控和对IUGR动物生长的影响。上述结果不仅为更进一步理解IUGR猪骨骼肌发育特征提供了基础数据,同时也为改善IUGR猪的生产性能提供新的见解和参考。