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[日的]肺癌是我国死亡率最高的恶性肿瘤,阻碍临床有效治疗的重要原因之一是肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)导致肿瘤局部免疫抑制发生。TME是肿瘤基质细胞与肿瘤细胞互作的内环境,肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma associated fibroblasts,CAFs)是TME重要组成部分,成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein,FAP)是CAFs的重要分子标识,通过促进肿瘤细胞增殖、TME基质降解重建、肿瘤脉管系统的建立及介导肿瘤免疫抑制等参与肿瘤进程。研究FAP阳性表达的CAFs与肿瘤细胞互作方式及分子机制,有利于探索FAP、CAFs和TME三者的关系,为阐明肿瘤微环境局部免疫抑制的机理奠定基础。[方法]1、从人肺癌组织中分离培养2株CAFs,WB和IF检测FAP、α-SMA、Vimentin的表达。本课题组已成功构建FAP过表达成纤维细胞系FAP-BJ、FAP-HFF及阴性对照细胞系NC-BJ、NC-HFF,WB和IF检测FAP、α-SMA、Vimentin的表达。2、体外直接共培养,CAF3、CAF4分别与Luciferase标记的SPC-A-1以4:1、2:1、1:1、1:2、1:4 比例;CAF3、CAF4、FAP-HFF 分别与 Luciferase 标记的 A549以1:8、1:16、1:32比例,检测SPC-A-1、A549 24h、48h、72h生物荧光素强度。3、体外间接共培养,CAF2、FAP-BJ 与 SPC-A-1 以 4:1 比例;CAF4、FAP-HFF与 A549 以 1:8 比例,CCK8 法检测 SPC-A-1、A549 24h、48h、72h 吸光度。4、裸鼠移植瘤实验,FAP-BJ、NC-BJ与SPC-A-1按4:1比例与Matrigel混匀接种裸鼠。物理测量肿瘤体积,活体荧光成像系统观察体内肿瘤细胞增殖情况。第28天处死裸鼠,测量肿瘤体积,HE染色。5、体外 HUVECs 小管形成实验,CAF2、CAF3、FAP-BJ、FAP-HFF 与 SPC-A-1按4:1比例直接共培养48h收集上清作为预处理培养基,刺激HUVECs细胞6h光镜下拍照,ImageJ软件量化小管形成总长度。6、体内 Matrigel-Plug 实验,CAF2、FAP-BJ、FAP-HFF 与 SPC-A-1 按 4:1比例与Matrigel混匀接种裸鼠,Day9尾静脉注射FITC-dextran,20mins后处死动物取出肿瘤组织观察血管形态和荧光强度,ImageJ软件量化血管荧光强度,IHC检测CD31的表达。7、FAP-BJ、NC-BJ分别与SPC-A-1、A549按4:1比例直接共培养48h后流式分选细胞,WB检测与成纤维细胞共培养后SPC-A-1、A549中FAP的表达以及与SPC-A-1共培养前后FAP-BJ中SCUBE3的表达。8、FAP-BJ、FAP-HFF、CAF1、CAF2、CAF3 与 SPC-A-1 按 4:1 比例直接共培养48h后收集上清,ELISA检测上清中SCUBE3分泌水平。[结 果]1、肺癌CAFs的鉴定和FAP过表达成纤维细胞系的鉴定WB 和 IF 结果显示 FAP 的表达 CAF4>CAF3>NF;Vimentin 和α-SMA 在CAF3、CAF4、NF、FAP-BJ、NC-BJ、FAP-HFF、NC-HFF 均有表达,但在 CAF4中表达均不明显。2、体外直接共培养CAF3、CAF4、FAP-HFF促肺癌细胞增殖检测生物荧光素强度,CAF3+SPC-A-1 组、CAF4+SPC-A-1 组>NF+SPC-A-1组(P<0.05),且 CAF4 促 SPC-A-1 的增殖作用强于 CAF3;CAF3+A549 组、CAF4+A549 组>NF+A549 组(P<0.05),FAP-HFF+A549 组>NC-HFF+A549组(P<0.05),成纤维细胞比例越大,促增殖能力越强。3、体外间接共培养CAF2、CAF4、FAP-BJ、FAP-HFF不促肺癌细胞增殖检测吸光度,CAF2+SPC-A-1组与NF+SPC-A-1组之间无统计学差异(P>0.05),CAF4刺激A549比NF组刺激A549增殖慢,与体外直接共培养比较无明显增殖作用;FAP-BJ+SPC-A-1 组与 NC-BJ+SPC-A-1 组,FAP-HFF+A549组与NC-HFF+A549组之间均无统计学差异(P>0.05)。4、体内FAP-BJ促肿瘤增殖情况第28天,物理测量肿瘤体积,FAP-BJ+SPC-A-1组>NC-BJ+SPC-A-1组、SPC-A-1组(P<0.05);检测活体荧光成像信号,FAP-BJ+SPC-A-1组>NC-BJ+SPC-A-1组、SPC-A-1组(P<0.05);处死裸鼠,物理测量肿瘤体积,FAP-BJ+SPC-A-1 组>NC-BJ+SPC-A-1 组、SPC-A-1 组(P<0.05)。5、体外CAF2、CAF3、FAP-BJ、FAP-HFF促血管生成情况ImageJ量化小管形成总长度,CAF2+SPC-A-1组、CAF3+SPC-A-1组>NF+SPC-A-1 组、SPC-A-1 组(P<0.05);FAP--BJ+SPC-A-1 组>NC-BJ+SPC-A-1组、SPC-A-1组(P<0.05)、FAP-HFF+SPC-1组>NC-HFF+SPC-A-1组、SPC-A-1组(P<0.05)。6、体内CAF2、FAP-BJ、FAP-HFF促血管生成情况ImageJ 量化血管荧光强度,CAF2+SPC-A-1组>NF+SPC-A-1 组、SPC-A-1组(P<0.05);FAP-BJ+SPC-A-1 组>NC-BJ+SPC-A-1 组、SPC-A-1 组(P<0.05),FAP-HFF+SPC-A-1 组>NC-HFF+SPC-A-1 组、SPC-A-1 组(P<0.05),IHC 结果显示CD31表达实验组均强于对照组(P<0.05)。7、共培养后SPC-A-1、A549中FAP的表达情况与FAP-BJ共培养后的SPC-A-1、A549细胞WB检测FAP表达上调。8、共培养前后FAP-BJ中SCUBE3的表达情况FAP-BJ细胞WB检测SCUBE3表达上调,且与SPC-A-1共培养后FAP-BJ细胞SCUBE3表达更高,即共培养后的FAP-BJ细胞>FAP-BJ细胞>NC-BJ细胞。9、成纤维细胞直接共培养上清中SCUBE3的分泌水平情况FAP-BJ、FAP-HFF、CAF2、CAF3 与 SPC-A-1 共培养上清 ELISA 检测 SCUBE3分泌水平均上调。[结论]1、分离鉴定CAF3和CAF4,均天然高表达FAP,且CAF4强于CAF3。2、在肺癌CAFs研究中,增殖方向,肺癌CAFs体外直接共培养促肺癌细胞增殖,体外间接共培养无明显促肺癌细胞增殖作用。血管生成方向,体内体外肺癌CAFs均促肺癌血管生成。3、在FAP过表达成纤维细胞研究中,增殖方向,FAP过表达成纤维细胞体外直接共培养促肺癌细胞增殖,体外间接共培养不促肺癌细胞增殖,体内促肺腺癌生长。血管生成方向,体内、体外FAP过表达成纤维细胞均促血管生成。4、共培养后SCEBE3蛋白的上调提示肿瘤微环境中FAP阳性表达的肺癌CAFs与肺癌细胞互作可能通过增强SCEBE3的表达从而促进肺癌生长。