【摘 要】
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本研究选择大鼠RSA14-44基因作为研究对象.RSA14-44基因位于大鼠染色体4q31,该基因是中国协和医科大学医学分子生物学国家重点实验室通过激光捕获显微切割(Laser Capture Mic
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本研究选择大鼠RSA14-44基因作为研究对象.RSA14-44基因位于大鼠染色体4q31,该基因是中国协和医科大学医学分子生物学国家重点实验室通过激光捕获显微切割(Laser Capture Microdissection,LCM)技术,构建大鼠初级精母细胞cDNA削减文库,并进一步用斑点杂交(Dot Blotting)分析,通过在互连网上的比对获得的新基因.全长为1124bp,可读编码框自100bp_684bp,编码194个氨基酸,推测其编码蛋白质分子量为21.8Kda.本研究中,首先利用RT-PCR检测了RSA14-44在多个组织中的表达,证明其在睾丸、附睾及脑组织中呈高表达,这为进一步对其功能的研究提供了新的思路.其次,将RSA14-44 cDNA克隆到pET30a(+)载体,在大肠杆菌中进行了pET30a(+)-14融合蛋白的表达与纯化.以纯化的pET30a(+)-14融合蛋白免疫新西兰大白兔,最后获得了抗pET30a(+)-14融合蛋白的多克隆抗体.利用该抗体进行的免疫组化研究显示,RSA14-44蛋白主要定位于大鼠睾丸生精上皮组织中的初级精母细胞、精子细胞和支持细胞.据此,又构建了包含RSA14-44 cDNA的pAS2-1-14重组克隆,并以其作为诱饵质粒,进行人睾丸cDNA文库的酵母双杂交筛选,获得了一条编码人20S蛋白酶体蛋白PSMB5的cDNA片段.进一步将RSA14-44cDNA和PSMB5克隆到pEGFP-N1载体,构建成功绿色荧光融合表达质粒pEGFP-N1-14和pEGFP-N1-PSMB5,将两种质粒载体分别转染CHO细胞后,借助碘化丙啶染色的细胞化学荧光技术和激光共聚焦显微镜观察发现,RSA14-44蛋白都定位在CHO细胞的细胞质,PSMB5在胞质和胞核中均有表达.将RSA14-44和PSMB5 cDNA分别克隆到pEGFP-N1和pDsRed1-N1载体中,在CHO细胞中进行的共定位研究显示,两种蛋白呈完全共定位.以上实验充分证明RSA14-44和PSMB5蛋白存在相互作用,为此,我们研究了RSA14-44和PSMB5相互作用后对泛素水解酶酶活性的影响,进行了初步的分析,发现二者单独作用时可分别显著提高泛素水解酶酶活性,并且共同转染细胞时极显著地提高了酶活性,这表明两者相互作用可能对生物学功能具有协同作用.研究中双杂交实验及体内外验证的结果首次表明,RSA14-44和PSMB5蛋白在体内外存在相互作用;从RSA14-44和PSMB5蛋白在细胞及组织中的定位,细胞蛋白酶体活性分析结果推测,在精子发生过程中,RSA14-44和PSMB5相互作用,在生殖细胞中调节细胞的增殖和分裂,在支持细胞中两者协同来调节精子发育过程中的蛋白降解.另外,RSA14-44蛋白都是与Rho蛋白的功能相似,或可能是Rho家族的成员之一.
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