副结核病(paratuberculosis)又称Johne’s病,是由分枝杆菌属副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium ssp.paratuberculosis,MAP)引起的一种以反刍动物为主的慢性、消耗性传染病。目前,该病在世界广泛流行,以奶牛业和肉牛业发达的国家危害严重,现已成为饲养业严重流行的传染病之一。另外,国外从人的Crohn’s病患者体内分离出MAP。因此,Johne’s病已引起了全世界的广泛关注。目前,该病尚无有效的治疗药物,因此该病的预防主要采取检出、隔离或淘汰,即以副结核PPD进行检疫,对检出的阳性牛进行隔离与淘汰。此外,国内外也有采用预防接种的方法来控制该病,即将MAP热灭活或致弱后制成疫苗,免疫接种牛和羊,可降低该病的发生率。但是疫苗接种后会使动物血清转为阳性,干扰变态反应和血清学检测,以及对结核菌素敏感,妨碍牛结核病和副结核病的变态反应检测。因此,有待开发新型的预防疫苗和诊断试剂,以促进畜牧业的健康发展。研究发现,副结核分枝杆菌培养滤液中存在的大量分泌蛋白能有效地诱发对副结核分枝杆菌的抵抗性,产生免疫保护作用。其中,SOD是副结核分枝杆菌的一种主要分泌蛋白。DNA疫苗能有效地刺激机体产生持久的体液免疫和细胞免疫应答,其中,激活CTL及杀灭靶细胞是DNA疫苗发挥保护作用的最主要机制之一,而且不干扰变态反应检测,这正是抗副结核感染所必需的。为了研制牛副结核病新型的预防制剂,尤其是DNA疫苗,本研究将重组质粒pGEM-T-SOD中的SOD基因亚克隆至真核表达载体pVAX1中,成功地构建出真核表达重组质粒pVAX1-SOD。以脂质体介导法将pVAX1-SOD转染至BHK-21细胞中,通过荧光抗体技术和RT-PCR方法证实SOD基因在哺乳动物细胞中获得了表达。以pVAX1-SOD分别对BALB/c小鼠和豚鼠进行了免疫,同时设pVAX1、生理盐水、副结核分枝杆菌超声抗原对照组。淋巴细胞转化试验结果表明,pVAX1-SOD免疫组与对照组间没有显著差异(P>0.05)。小鼠脾脏CD3~+T、CD4~+T、CD8~+T细胞检测结果显示,pVAX1-SOD免疫组的CD4~+T、CD8~+T细胞数量与生理盐水、pVAX1对照组间没有差异,而CD3~+T细胞数量则存在差异,但没有达到统计学上的显著水平(P>0.05)。pVAX1-SOD免疫小鼠脾细胞培养上清的IFN-γ含量显著地高于生理盐水、pVAX1对照组(P<0.05)。间接ELISA检测结果表明,免疫小鼠体内产生了针对SOD抗原的特异性抗体。豚鼠变态反应结果显示,pVAX1-SOD免疫组与副结核分枝杆菌超声抗原对照组差异极显著(P<0.01),表明重组质粒免疫并不干扰变态反应检测。上述研究结果表明,本研究构建了副结核分枝杆菌SOD基因的真核表达质粒,该表达质粒在实验动物体内产生了特异性的体液免疫和细胞免疫。为进一步研究该基因的免疫保护作用,以及研制预防副结核病的DNA疫苗奠定了基础。