恶性淋巴瘤是原发于淋巴结和其他器官淋巴组织的恶性肿瘤，是造血系统恶性疾病之一，也是目前发病率增长最快的恶性肿瘤之一。恶性淋巴瘤的病因，包括病毒感染、环境因素、化学因素等，目前倾向于多种因素作用的结果。 现已知抗肿瘤药物多是通过诱导细胞凋亡而清除肿瘤细胞的。Bcl-2基因家族是细胞凋亡的重要调控基因，所编码的蛋白通常被分为抗凋亡蛋白(如Bcl-2和Bcl-xL)和促凋亡蛋白(如Bak和Bax等)，广泛表达于血液淋巴系统的肿瘤细胞，并对恶性淋巴瘤的发生和发展起着重要的作用。Bcl-2蛋白的活性受其Bax调节，Bax能自身形成同源二聚体(Bax/BaX)而诱导凋亡，Bcl-2可与Bax形成异源二聚体(Bcl-2/Bax)以抑制凋亡。Bcl-xL是Bcl-2家族的主要调节凋亡抑制因子，鉴于Bel-2和Bcl-xL蛋白对于抑制肿瘤细胞凋亡中所起的重要作用，人们尝试将其作为肿瘤治疗分子靶点。 Mcl-1蛋白是一类与Bcl-2蛋白质具有35％的同源性的蛋白质，Mcl-1在许多细胞凋亡过程中表达下调，Caspase介导的对Mcl-1的分解可能是其表达下调的主要原因。研究表明Mcl-1在B细胞非何杰金淋巴瘤(B-NHL)中表达上调，并且与B-NHL的恶性程度呈正相关，Mcl-1主要表达于高度恶性组，在低度恶性组中为弱表达或阴性表达。因此Mcl-1在B-NHL的发生、发展以及生物学行为中具有重要作用。凋亡缺陷可以导致恶性肿瘤的发生和发展，转基因小鼠Mcl-1过表达导致淋巴瘤发病率增加，表明Mcl-1可以直接导致恶性肿瘤的发生。Mcl-1在人类恶性肿瘤细胞广泛表达，越来越多的研究表明Mcl-1在临床疾病中是一个有效的预后预测指标。为难治性肿瘤的治疗开辟了一条新途径。提供药物干预的靶点，可开发研制抗肿瘤新药。所以Mcl-1是未来新的抗癌治疗策略中一个新的靶点。 棉酚是非甾体男用口服避孕药物，研究发现棉酚除具有抗生育、抑制寄生生物体生长和抗病毒(包括HIV病毒)的作用外，还具有抗肿瘤作用。 有关棉酚抗肿瘤作用的报道，其中涉及对黑色素瘤、结肠癌细胞、Ehrlich腹水瘤、P388、L1210鼠白血病、SW-13。肾上腺皮质肿瘤、鼠红白血病细胞(克隆6A11A)、人神经胶质瘤细胞株(HS683，U373，U87，U138)、乳腺癌MCF-7(敏感株和耐药株)、黑色素细胞株(SK-mel-19和SK-mel-28)、白血病HL-60、乳腺癌细胞株T47D、卵巢癌OVCAR-3、结肠癌HT-29和LoVo、转移性MAT-LyLu肺癌细胞等多种细胞具有增殖抑制或抗转移活性。临床试验也已证实棉酚对转移性肾上腺肿瘤，神经胶质瘤和难治性转移性乳癌具有疗效。 荧光偏振技术的研究发现棉酚具有结合Bcl-2和Bcl-xL蛋白的能力，为避免两个醛基带来的非特异性毒性，设计合成了ApoG2，ApoG2已被证实可以有效地与Mcl-1和Bcl-2蛋白结合，并具有良好的稳定性，可以对抗酸，碱，光照和过氧化物。由于ApoG2是全新改造的化合物，有关的ApoG2用于抗肿瘤研究尚未有报道，将ApoG2用于恶性淋巴瘤的研究在国内外也属于空白，因此是一个崭新的领域。 本研究的目的是：将ApoG2用于恶性淋巴瘤细胞的研究。研究ApoG2体外对外抗淋巴瘤细胞的增殖作用，并研究其诱导淋巴瘤细胞凋亡的机理。 [方法与结果]:第一章：Bcl-2家族蛋白在Ramos、Namalwa、Jurkat、U937及Raji淋巴瘤细胞中的表达； 方法：取对数生长期的Ramos、Namalwa、Jurkat、U937及Raji淋巴瘤细胞，提取细胞总蛋白，进行蛋白定量，westernblot法测定Bcl-2、Bax及Bcl-xL蛋白的表达。 结果：Bcl-2蛋白在除Ramos细胞外的Namalwa、Jurkat、U937及Raji细胞均有表达；Bax蛋白在除Namalwa细胞外的Ramos、Jurkat、U937及Raji细胞均有表达；Bcl-xL及Mcl-1蛋白在Ramos、Namalwa、Jurkat、U937及Raji五种细胞均有表达。 第二章：ApoG2对Ramos、Namalwa、Jurkat、U937及Raji淋巴瘤细胞株的体外抗增殖活性； 方法：取对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔板，设ApoG2不同的浓度及相应的溶剂对照组。采用CCK-8法测定每孔OD值，Bliss法计算半数抑制浓度(IC50值)。 结果：ApoG2对以上5种淋巴瘤细胞均有增殖抑制作用，显示出良好的抗肿瘤活性。IC50值分别为：Ramos细胞：9.54±1.01μM；Namalwa细胞：9.84±0.85μM；Jurkat细胞：8.49±0.56μM：U937细胞：9.26±1.76μM；Raji细胞：9.82±0.87μM。 进一步检测了不同作用时间下ApoG2对U937细胞的生长抑制作用的影响，发现随ApoG2对U937细胞的抑制作用随时间的延长而加大；其24h、48h和72h的IC50值分别为30.08±0.56μM，14.81±1.76μM和9.26±1.76μM。 第三章：ApoG2对U937细胞周期及相关的细胞周期调控蛋白的影响； 3.1 流式细胞仪检测细胞周期分布方法：收集不同浓度ApoG2处理的U937细胞，采用流式细胞仪检NDNA的含量，LYSIS软件分析。 结果：不同剂量ApoG2分别作用U937细胞12h后，细胞出现不同程度的G1期阻滞，呈剂量依赖性。 3.2 Westernblot法检测细胞周期调控蛋白的表达情况方法：不同浓度的ApoG2分别处理U937细胞12h、24h和148h后，及用10μM分别作用于U937细胞6h、12h、24h和48h，收集细胞，提取总蛋白，定量。用等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，按常规转印及封闭，分别标记一抗，二抗，暗室中曝光，冲片。 结果： (1)经10μM的ApoG2分别作用于U937细胞6h、12h、24h、48h后，P21蛋白表达量与对照组相比呈升高趋势，于24h表达升至最高，48h的表达量下降； CyclinE蛋白的表达量与对照组相比呈下调趋势，于12h表达降至最低； CyclinD1蛋白的表达量与对照组相比呈下调趋势，于12h表达降至最低； C-myc蛋白的表达量与对照组相比呈下调趋势，于48h表达降至最低。 (2)不同剂量(5、10、20μM)的ApoG2分别作用于U937细胞12h，24h和48h后： P21蛋白：12h后的P21蛋白表达水平与对照组相比无明显变化；24h后的P21蛋白表达随药物剂量升高呈剂量依赖性上调；48h后的P21蛋白的表达随药物剂量(5、10、20μM)升高而上调。 CyclinE蛋白：12h后的表达未成明显的剂量依赖性下调，其水平与对照组相比表达减少；24h及48h后的蛋白表达量均随药物剂量升高呈明显的剂量依赖性下调。 CyclinD1蛋白：12h，24h及48h后的表达量与对照组相比表达减少，均呈明显的剂量依赖性下调趋势。 C-myc蛋白：12h，24h及48h后的表达量与对照组相比表达减少，均呈明显的剂量依赖性下调趋势。 第四章：ApoG2诱导U937细胞凋亡及机理研究。 4.1流式细胞仪检测细胞凋亡流式细胞仪分析显示，U937细胞经不同剂量ApoG2分别处理12h、24h、48h后，有不同程度的亚G1峰(凋亡峰)出现，并呈一定的剂量依赖性和时间依赖性。 4.2DNA梯形条带检测用细胞凋亡DNAladder检测试剂盒检测发现，ApoG2处理后的细胞在DNA琼脂糖凝胶电泳图谱上出现特征性的梯形条带。 4.3.荧光显微镜观察凋亡小体不同浓度的ApoG2分别处理U937细胞48h后，DAPI染色结果：对照组细胞核形态完整、染色均匀，10μMApoG2处理U937细胞48h后，细胞核出现浓缩、颗粒化并有凋亡小体出现，随着药物处理剂量增大细胞核破坏更加明显。 4.4Caspase-3、Caspase-9活性检测及Caspase-3蛋白的表达经ApoG2处理U937细胞12h后，细胞中Caspase-3和Caspase-9的活性明显升高且呈剂量依赖性。U937细胞在经10μM的ApoG2分别作用6h、12h和24h后，pro-caspase-3的活性断裂片段随作用时间而增多。 结果显示：线粒体cytoc释放随ApoG2呈剂量依赖性上调。 结论：1.棉酚衍生物ApoG2对于人淋巴瘤细胞株具有明显的抗增殖作用。 2.ApoG2能够使U937细胞CyclinE，CyclinD1及c-myc蛋白明显下调，从而诱导U937细胞出现明显的G1期阻滞。 3.ApoG2可以阻断Bcl-2/Bax异源二聚体的形成，促进细胞色素c由线粒体释放，激活Caspase-9和-3，启动细胞内凋亡途径，从而诱导U937细胞凋亡。