论文部分内容阅读
食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，早期的转移及侵袭是食管癌高死亡率的主要原因。黏着斑激酶(FAK)，是一个125 kD的非受体型酪氨酸激酶，多项研究中均证实，FAK在食管癌的发生发展中扮演着重要的角色。近年来，FAK在肿瘤干细胞与肿瘤微环境以及上皮间质转化(EMT)中的作用逐渐成为研究的热点。上皮间质转化(EMT)是指上皮细胞受到细胞外因子刺激后向间质细胞转化的过程，细胞间连接减少，同时与细胞周围基质粘连减少，细胞骨架重构，细胞运动能力增加。 蟾蜍灵(Bufalin)是从传统中药蟾酥中提取的具有抗肿瘤作用的洋地黄类物质。但是Bufalin在食管癌中的具体作用机制仍然不明确。本实验室前期对Bufalin在食管癌中Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路中的作用作了大量实验研究，发现Bufalin可以通过下调ERK的磷酸化水平，发挥抗肿瘤作用。为了更好的了解食管癌发生发展的具体机制，本实验通过体内体外实验，研究了Bufalin对食管癌中FAK活化和上皮间质转化的影响，从而进一步探讨Bufalin在食管癌中抗肿瘤的作用机制。 目的: 探讨Bufalin对食管癌中FAK活化和上皮间质转化的影响。 方法: 1、RT-PCR方法检测不同浓度Bufalin对食管鳞状细胞癌ECA109细胞FAK、E-Cadherin、Vim mRNA表达的影响。 2、Western Blot方法检测不同浓度Bufalin对ECA109细胞FAK活化水平及FAK、E-Cadherin、Vim蛋白表达的影响。 3、采用划痕愈合和Transwell小室实验检测不同浓度Bufalin对ECA109细胞迁移与侵袭能力的影响。 4、建立36只人食管鳞状细胞癌ECA109细胞裸鼠原位移植瘤模型，随机分为6组，即模型组、Bufalin低剂量组（0.5mg/kg，BL）、Bufalin中剂量组(1mg/kg，BM)、Bufalin高剂量组(1.5mg/kg，BH)、PF562271组（FAK抑制剂）、高剂量Bufalin与PF562271组联合应用组(BP)，持续腹腔注射药物30天。用药期间观察裸鼠饮食和精神状态变化，记录裸鼠体重和肿瘤大小数据。 5、用药结束后处死全部裸鼠，测量肿瘤大小并计算肿瘤抑制率。 6、HE染色检测各组裸鼠移植瘤肿瘤组织镜下表现。 7、Real time-PCR检测各组裸鼠移植瘤中FAK、E-Cadherin、Vim mRNA的表达。 8、免疫组化法检测各组裸鼠移植瘤中FAK活化水平及FAK、E-Cadherin、Vim蛋白的表达。 结果: 1、Bufalin对食管鳞状细胞癌ECA109细胞FAK表达及活化水平的影响 RT-PCR结果表明Bufalin抑制FAK mRNA的表达。阳性对照组，20，40，60，80，100 nmol/L Bufalin及PF562271组，FAK mRNA的相对表达量分别为1.276±0.046，1.154±0.027，0.619±0.026，0.556±0.0172，0.439±0.022，0.221±0.0206，0.210±0.0285，与阳性对照组相比，药物干预组FAK相对表达量逐渐减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)。Western Blot结果表明Bufalin抑制FAK的活化。阳性对照组，20，40，60，80，100 nmol/LBufalin及PF562271组，FAK的相对表达量分别为1.255±0.111，1.357±0.050,1.177±0.065,1.278±0.099,1.239±0.196,1.199±0.106,1.188±0.094，药物干预组与阳性对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05);FAK活化水平的相对表达量分别为1.315±0.020，1.159±0.058，1.002±0.069，0.773±0.027，0.589±0.027，0.410±0.026，0.379±0.044，与阳性对照组相比，药物干预组FAK活化水平的相对表达量逐渐减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 2、Bufalin对食管鳞状细胞癌ECA109细胞EMT的影响 RT-PCR结果表明Bufalin增加E-Cadherin mRNA的表达，降低VimmRNA的表达。阳性对照组，20，40，60，80，100 nmol/L Bufalin及PF562271组，E-Cadherin mRNA的相对表达量分别为0.231±0.016，0.435±0.048，0.568±0.034,0.669±0.025,0.842±0.031,0.939±0.036,0.948±0.027，与阳性对照组相比，药物干预组相对表达量逐渐增加，差异具有统计学意义(P＜0.05);Vim mRNA的相对表达量分别为0.852±0.051，0.682±0.025，0.567±0.034，0.431±0.047，0.300±0.016，0.212±0.024，0.190±0.022，与阳性对照组相比，药物干预组的相对表达量逐渐减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)。Western Blot结果表明Bufalin增加E-Cadherin蛋白的表达，降低Vim蛋白的表达。阳性对照组，20，40，60，80，100 nmol/L Bufalin及PF562271组，E-Cadherin的相对表达量分别为0.351±0.009，0.459±0.006,0.515±0.006,0.619±0.006,0.756±0.005,0.859±0.007，0.867±0.005，相对表达量逐渐增加，差异均有统计学意义(P＜0.05);Vim蛋白的相对表达量分别为1.257±0.043，1.150±0.038，0.854±0.032，0.754±0.025，0.621±0.028，0.552±0.034，0.539±0.040，相对表达量逐渐减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。 3、Bufalin对食管鳞状细胞癌ECA109细胞迁移及侵袭能力的影响 实验结果表明Bufalin可以抑制ECA109细胞的迁移及侵袭。药物干预组（20，40，60，80，100 nmol/L Bufalin及PF562271组）与阳性对照组相比较，划痕实验结果显示细胞划痕距离由1.156±0.118增加至1.556±0.249，2.981±0.167，3.685±0.121，4.614±0.170，5.316±0.104，5.795±0.178;Transwell迁移实验结果显示穿过基底膜的细胞个数由107.00±8.19下降至78.67±3.06，61.67±3.06，42.67±3.512，24.33±2.517，10.33±3.215，9.00±2.65; Transwell侵袭实验结果显示穿过基底膜的细胞个数由127.67±8.02下降至102.33±4.51，87.33±7.10，73.00±4.58，57.33±2.52，39.00±3.61，37.33±2.52，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 4、裸鼠移植瘤实验中模型组、BL组、BM组、BH组、PF562271组、BP组裸鼠饮食及精神状态未见异常;用药前后各组裸鼠体重差异无统计学意义(P＞0.05)。 5、Bufalin对裸鼠食管鳞状细胞癌移植瘤生长的影响 模型组、BL组、BM组、BH组、PF562271组、BP组裸鼠肿瘤体积分别为2.430±0.052cm3,2.378±0.042cm3,1.805±0.052cm3,1.722±0.072cm3，1.703±0.062cm3，1.128±0.064cm3肿瘤体积逐渐减小，与模型组相比，BM组、BH组、PF562271组、BP组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。各用药组的肿瘤抑制率分别为4.4％，45.6％，63.5％，65.2％，71.1％。 6、各组裸鼠原位移植瘤瘤组织HE染色镜下特点 各组裸鼠原位移植瘤瘤组织HE染色切片，均呈低分化鳞状细胞癌的特点，癌细胞异形性明显，细胞形态多样，排列成大小不等的实性巢，核大深染，核染色质呈粗颗粒状，核仁明显，少见细胞间桥及角化。 7、Bufalin对裸鼠食管鳞状细胞癌原位移植瘤中FAK表达、活化水平及EMT的影响 Real time-PCR结果表明Bufalin可以降低FAK的表达，增加E-Cadherin的表达，降低Vim的表达。BL组、BM组、BH组、PF562271组、BP组，各组FAK mRNA的相对表达量逐渐降低，分别为0.956±0.015，0.677±0.041,0.516±0.019,0.480±0.015,0.343±0.022;各组E-CadherinmRNA的相对表达量逐渐增加，分别为1.137±0.140，1.840±0.095，2.593±30.127，2.600±0.151，3.245±0.100;各组Vim mRNA的相对表达量逐渐降低，分别为1.004±0.033，0.791±0.027，0.540±0.026，0.501±0.015，0.399±0.023，与模型组相比，BM组、BH组、PF562271组、BP组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。免疫组化结果表明Bufalin可以降低FAK的表达及活化，增加E-Cadherin的表达，降低Vim的表达。模型组、BL组、BM组、BH组、PF562271组、BP组免疫组化结果:FAK免疫反应积分平均秩次分别为49.20，46.70，36.35，24.60，20.10，6.05，FAK蛋白表达逐渐降低;FAK活化水平各组免疫反应积分平均秩次分别为46.90，40.50，31.15，26.00，22.80，15.65，FAK活化水平逐渐降低;E-Cadherin免疫反应积分平均秩次分别为8.75，14.00，24.40，40.60，42.5，52.75，E-Cadherin蛋白表达逐渐增加;Vim免疫反应积分平均秩次分别为51.00，47.90，36.40，21.10，20.20，6.40，Vim蛋白表达逐渐降低，与模型组相比，BM组、BH组、PF562271组、BP组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结论: 1、Bufalin可以抑制ECA109细胞的迁移及侵袭。 2、Bufalin可以抑制裸鼠食管鳞状细胞癌移植瘤的生长。 3、Bufalin可以抑制食管鳞状细胞癌中FAK的活化，提示Bufalin可能是通过下调FAK来抑制食管鳞状细胞癌上皮间质转化过程。