目的构建CVB32A蛋白酶的真核表达载体和缺失突变体,观察2A及缺失突变体对细胞蛋白翻译的影响。探讨CVB3病毒的蛋白酶2A对真核细胞帽样蛋白翻译途径和内部核糖体进入位点(IRES)翻译途径的影响。方法利用分子克隆技术构建pcDNA3.1-CVB3-2A及其缺失突变体质粒,将CVB3-2A对真核细胞蛋白翻译的影响机制：1. Western Blot检测pcDNA3.1-CVB3-2A与CVB3病毒对细胞内eIF4GI和PABPI表达的影响；2. Western Blot检测pcDNA3.1-CVB3-2A缺失突变体对细胞内eIF4GI表达的影响；3.将pcDNA3.1-CVB3-2A及其缺失突变体质粒分别与表达绿色荧光蛋白(GFP)的pEGFP-n1质粒共转染,在倒置显微镜下,观察GFP的表达量；4.将pcDNA3.1-CVB3-2A与帽样结构依赖的荧光素酶蛋白(luciferase)的pGL3-F-luc质粒共转染,检测荧光素酶的活性；5.将pcDNA3.1-CVB3-2A及其缺失突变体质粒分别与表达GFP的pIRES-GFP质粒共转染,在倒置显微镜下,观察GFP的表达量；6.将pcDNA3.1-CVB3-2A及其缺失突变体质粒转染细胞,利用免疫荧光技术制备好标本片,通过共聚焦显微镜观察2A及其突变体入核的情况。结果1.CVB32A蛋白酶的真核表达载体pcDNA3.1-CVB3-2A质粒和CVB3病毒,均能引起细胞内eIF4GI的降解；CVB3病毒也能导致PABPI降解,而pcDNA3.1-2A对PABPI无明显作用；2. CVB32A蛋白酶的4个缺失突变体对细胞内eIF4GI均无明显作用：3. CVB32A蛋白酶的真核表达载体pcDNA3.1-CVB3-2A质粒转染细胞可抑制pEGFP-N1质粒表达的帽样依赖的GFP表达,而4个缺失突变体对GFP的表达量无影响；4. CVB32A蛋白酶的真核表达载体pcDNA3.1-CVB3-2A质粒转染细胞可抑制转染pGL3-F-luc质粒的酶活性；5. CVB32A蛋白酶的真核表达载体pcDNA3.1-CVB3-2A质粒转染细胞导致pIRES-GFP质粒表达的GFP表达量增加。而4个缺失突变体对GFP的表达量无影响；6. CVB32A蛋白酶的真核表达载体pcDNA3.1-CVB3-2A质粒与其它三个缺失突变体均表达在细胞质,而pcDNA3.1-2A C端缺失有明显入核现象。结论1.CVB3的2A蛋白酶能够切割真核细胞的eIF4GI,从而对真核细胞蛋白的帽样翻译途径起抑制作用；2.CVB3的2A蛋白酶促进IRES蛋白合成途径；3. CVB3-2A C端缺失可明显入核。