致病杆菌(Xenorhabdus sp.)是一类与斯氏线虫(Steinernema sp.)互利共生的昆虫病原细菌,革兰阴性,杆状,兼性厌氧。该类细菌能够分泌多种毒素物质作用昆虫中肠、干扰宿主的免疫反应,最终导致昆虫宿主死亡。在前期研究中,课题组分离得到一株对靶标昆虫具有高毒力的X.stockiae新菌株HN_xs01。为了研究HN_xs01菌株的毒素,我们构建了Fosmid基因组文库,该文库包含了12950个克隆,分别保藏在80个克隆管中。对随机挑取的24个克隆进行限制性酶Not I酶切分析表明,插入片段大小在30~45 kb之间,未发现空载情况。该文库覆盖了HN_xs01菌株基因组的7.2倍,得到任意单拷贝DNA序列的概率为99.9%。继代培养6 d后对文库进行稳定性检测表明,在传代过程中克隆没有出现插入片段丢失或重排的情况。此外,为了方便后续复筛工作的顺利进行,我们对初筛克隆管中的克隆采用了构建二级池,以减少工作量、快速定位目的单克隆。以枞色卷蛾中肠细胞系(CF203/2.5),草地夜蛾卵巢细胞细胞系(Sf9),以及多种肿瘤细胞作为靶标细胞,我们从Fosmid文库中筛选到具有细胞毒性的FS2克隆管。构建FS2克隆管的二级池进行复筛,最终确定具有细胞毒性的Fosmid单克隆为FS2C1。通过测序和同源比对分析,发现FS2C1克隆中含有SrfABC三元复合毒素编码基因的同源序列。利用Red/ET同源重组技术,我们敲除了FS2C1克隆中的srfABC基因。与野生型菌株相比,srfABC基因缺失突变株完全丧失了对CF203/2.5的细胞毒性,这表明:SrfABC毒素可能是FS2C1克隆中主要或唯一的细胞毒素。接下来,我们PCR扩增了srfABC全长基因并在E.coli中异源表达,提取全蛋白进行细胞毒性测定,实验结果证实:表达了SrfABC毒素的菌体全蛋白对CF203/2.5具有很高的细胞毒性。激光共聚焦显微镜下观察发现:低浓度下,SrfABC毒素处理后的CF203/2.5细胞中有完整的细胞骨架,但细胞核皱缩、线粒体消失;而高浓度下,毒素处理后的细胞核凝聚,细胞骨架解聚,线粒体消失。综合以上实验结果,我们推测:SrfABC毒素可能作用靶点为细胞的线粒体。DNA Ladder实验发现:与对照组相比,经SrfABC毒素处理的实验组中的DNA出现了成倍降解条带,暗示该毒素可能引起细胞凋亡,具体机制有待进一步研究和证实。本研究还构建了Srf A,SrfB,SrfC三组分单独表达载体。经IPTG诱导、纯化、脱盐后的三种目的蛋白分别作用CF203/2.5细胞,其中SrfA单独作用时,在低浓度下就具有很高的细胞毒性,而SrfB和SrfC组分只有在高浓度下才能抑制细胞增殖,我们推测:Srf A组分是毒素复合物中的酶活性组分,而SrfB和SrfC是辅助组分。本研究为进一步研究SrfABC毒素的作用机制,明确SrfABC毒素在致病杆菌菌株中抵抗宿主防御、发挥毒性作用以及在宿主定殖中的重要作用提供了实验基础,为更好的利用致病杆菌进行害虫防治提供了理论依据;也将为利用微生物毒素进行基础研究、疾病治疗、生物防治等提供新思路。