【摘 要】
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A型流感病毒可以感染禽类和哺乳动物等多种宿主,亚型多且感染谱广,其跨种间传播往往造成严重危害甚至大流行,因此其复制及跨种传播机制一直是本领域研究热点。流感病毒的RNA聚合酶是病毒在宿主细胞内进行转录与复制的物质基础,在跨物种传播中发挥重要作用,其需借助某些宿主蛋白来完成病毒的复制过程。目前关于流感病毒聚合酶对宿主的依赖机制及跨物种适应机制仍知之甚少。已有研究发现禽源酸性核磷蛋白32（ANP32）家
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A型流感病毒可以感染禽类和哺乳动物等多种宿主,亚型多且感染谱广,其跨种间传播往往造成严重危害甚至大流行,因此其复制及跨种传播机制一直是本领域研究热点。流感病毒的RNA聚合酶是病毒在宿主细胞内进行转录与复制的物质基础,在跨物种传播中发挥重要作用,其需借助某些宿主蛋白来完成病毒的复制过程。目前关于流感病毒聚合酶对宿主的依赖机制及跨物种适应机制仍知之甚少。已有研究发现禽源酸性核磷蛋白32（ANP32）家族蛋白成员ANP32A与禽流感病毒聚合酶的种属特异性相关,但ANP32A及其家族其他蛋白与流感病毒聚合酶相互作用及功能并不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了一系列聚合酶相关宿主蛋白的HEK293T敲除细胞系,转染H1N1亚型流感A/Sichuan/01/2009（H1N1SC09）聚合酶报告系统,检测发现人ANP32A（huANP32A）或ANP32B（huANP32B）单独敲除时均不影响聚合酶活性。由于ANP32A与ANP32B为结构类似的同一家族蛋白,因此推测二者可能功能类似,单独敲除一个蛋白,另一个蛋白仍会发挥作用,因此该团队构建了 ANP32A&B双敲除的细胞系（DKO）。将不同亚型人流感病毒聚合酶报告系统转染huANP32A单敲除细胞系（AKO）、huANP32B单敲除细胞系（BKO）及DKO,结果显示,在同时缺失huANP32A和huANP32B的情况下（DKO细胞系）,不同亚型流感聚合酶活性均下降10000倍以上;同样,WSN病毒感染实验也表明DKO细胞系上病毒的生长复制下降10000倍以上。单独和同时回补ANP32A和ANP32B均可恢复DKO细胞对流感病毒复制的支持,此结果证实huANP32A和huANP32B是不同亚型人流感病毒复制所必须的宿主蛋白。本研究又评估了不同物种（人、禽、马、猪、犬）流感病毒对不同物种ANP32蛋白的依赖性,发现不同物种流感病毒的聚合酶活性均需要ANP32蛋白的支持,首次揭示了ANP32A和ANP32B是不同物种流感病毒聚合酶发挥功能的决定性宿主蛋白。进一步研究发现禽源ANP32B由于关键位点129/130氨基酸的突变,导致其天然丧失对流感病毒聚合酶活性的支持,证明禽ANP32A成为独立支持流感病毒聚合酶活性的ANP32家族蛋白。研究同时发现129/130位点是所有物种ANP32A及ANP32B的与流感病毒聚合酶结合的关键位点,也是其发挥支持聚合酶活性的关键功能位点。突变该位点后所有ANP32蛋白均丧失了与流感病毒聚合酶的结合能力及对流感病毒聚合酶活性的支持。猪一直被认为是禽流感病毒跨物种传播到人的中间宿主,但关于禽流感病毒RNA聚合酶在猪体内的适应机制目前并不明确。基于前期研究结果,本研究进一步利用聚合酶双荧光报告系统,检测了不同物种ANP32A&B蛋白对人、禽、猪、犬、马等不同物种流感病毒的支持作用,结果提示,相较于其他哺乳动物ANP32A或ANP32B蛋白,猪ANP32A（pgANP32A）蛋白能够特异性支持禽源H7N9及H9N2亚型流感病毒聚合酶活性。免疫共沉淀结果提示,与huANP32A相比,pgANP32A能特异性与禽源聚合酶复合体结合,从而支持禽源聚合酶的活性。通过构建猪源PK15细胞ANP32A敲除细胞系（PK15-AKO）结合聚合酶活性分析及流感病毒感染实验证明,pgANP32A的缺失导致聚合酶活性及病毒复制滴度显著下降,提示pgANP32A是猪源PK15细胞可以特异性支持禽流感病毒复制的关键因子。通过定点突变结合聚合酶活性分析,明确了pgANP32A蛋白的106V/156S位点是其发挥支持禽源聚活性的关键位点,也是影响其与禽源聚合酶复合物结合的关键位点。本研究首次揭示了 ANP32A与ANP32B蛋白在不同物种流感病毒复制过程中发挥着决定性作用,首次从宿主因子角度分析猪作为中间宿主支持禽流感病毒的分子机制,明确了 ANP32蛋白发挥作用的关键位点,为新型抗流感药物和转基因动物的研发提供有效靶点。
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