论文部分内容阅读
目的新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是各种原因致神经细胞变性丢失和组织囊泡化,引起大脑结构及功能受损,导致永久性神经功能损伤,引起运动、学习和记忆障碍,从而产生诸多严重后遗症,是导致脑性瘫痪(发生率为3‰-5‰)的重要原因,近年来随着新生儿抢救技术的提高,发病率逐渐增高,而目前的治疗方法疗效欠佳。迫切需要寻找新的合理有效的治疗措施,替代补充损伤的神经细胞,改善患者预后。源于人脐血单个核细胞(human umbilical cord blood mononuclear cells UBC-MNCs)的神经干细胞(neural stem cells NSCs)具有自我更新和多向分化潜能,是未成熟的神经前体细胞,在一定条件下可增殖分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,NSCs移植可替代损伤的神经细胞,整合到神经回路中,可使受损的神经功能得到改善,是有效的细胞重建途径,是治疗HIBD的新理念。影响NSCs增殖、定向分化的因素非常复杂,可归结为内因和外因两个方面。内因主要是自身基因的调控,如Foxgl基因和Nestin基因等,通过激活相关转录因子,活化或者抑制相关基因的转录,诱导细胞增殖分化；外因主要是细胞因子和微环境中外来信号的调控作用,如hEGF、bFGF和B27因子等,在微环境中,胞外基质的各种成分通过调节粘着性和迁移能力,以及结合在胞外基质上的各种生长因子和细胞因子间的相互作用,影响NSCs的增殖和分化。本实验通过体外培养脐血源性NSCs,研究影响NSCs增殖分化的关键调控因子Nestin及Foxgl的mRNA的表达情况及相互关系,经BrdU标记的NSCs经静脉移植到HIBD新生大鼠体内,从新生大鼠组织学改变、行为学表现和学习记忆能力方面对疗效作出评价,探讨NSCs移植治疗新生鼠HIBD的可行性及时效性,为临床上NSCs移植治疗新生儿HIBD提供更充分的理论依据。方法1.采用密度梯度离心法从脐血中分离出UBC-MNCs,用含hEGF、bFGF和B27因子的Neurobasal培养基联合诱导其向NSCs方向分化,观察培养过程中UBC-MNCs增殖分化及形态学特点,免疫组化法检测培养细胞中神经细胞标志抗原Nestin、NSE、GFAP蛋白的表达情况；RT-PCR法检测诱导前后培养细胞中Foxg1和Nestin基因mRNA的表达变化。2.BrdU标记培养靶细胞并测定细胞增殖指数,标记细胞经尾静脉移植到7d模型HIBD新生大鼠体内,免疫组化法检测移植后1d、7d、14d、21d各组动物脑组织易损区SVZa区Nestin、NSE、GFAP、BrdU染色阳性细胞表达情况及移植细胞在脑内的存活、迁移和分化情况,HE染色作病理学分析。分别于移植后1d、7d、14d、21d进行大鼠神经功能评定和Y迷宫试验,观察细胞移植对HIBD新生大鼠的治疗作用。结果1.脐血单个核细胞可定向诱导分化为神经元样细胞,形成典型NSCs克隆团,表达Nestin、NSE、GFAP标记抗原蛋白,诱导前细胞Nestin、NSE、GFAP的表达均非常低,诱导6d时Nestin阳性细胞数达高峰,然后开始下降,NSE、GFAP阳性细胞数逐渐增高。BrdU标记靶细胞阳性率达90%。2.Foxg1 mRNA和Nestin mRNA在诱导前细胞中低表达,诱导后逐渐升高(P<0.01),6d达高峰,9d、12d时逐渐下降(P<0.05),诱导3d、6d、9d、12d后,Nestin mRNA表达始终较Foxg1 mRNA表达量低。3.各组动物SVZa区Nestin阳性细胞表达量早期升高,后期下降,NSCs移植组上升较快,移植后14d时达高峰,后逐渐下降。正常对照组、NSCs移植组SVZa区NSE阳性细胞表达量总体逐渐升高,其中NSCs移植组升高较快,模型对照组表达逐渐降低。移植后1d,Nestin和NSE阳性细胞表达量各组间比较,P>0.05。SVZa区GFAP染色阳性细胞表达量逐渐升高,模型组表达最高,NSCs移植组最低；NSCs移植组SVZa区BrdU表达阳性,BrdU阳性细胞可趋化至左侧SVZa区并存活,由缺血周围区向中央坏死区迁移,损伤区面积与模型组相比显著减小。随着细胞移植时间延长,BrdU表达不断增强,P<0.05。4.与正常对照组相比,HIBD动物的学习记忆能力明显下降(P<0.05),NSCs移植组与模型组相比,移植后1d大鼠的学习、记忆能力无明显差异,移植后7d、21d学习记忆能力不断提高(P<0.05),移植组与模型组相比有显著差异(P<0.05)。结论1.体外诱导培养可获得UBC-MNCs源性NSCs,脐血能够成为NSCs的新来源。2.Foxgl基因和Nestin基因是NSCs增殖分化的关键调控因子。3. NSCs移植可促进HIBD新生大鼠SVZa区结构恢复和细胞功能重建,提高其学习和记忆能力,促进行为功能障碍的恢复。4.NSCs移植后可有效抑制新生大鼠HIBD后损伤性体格发育障碍的继续发展,促进大鼠生长发育。5.人脐血NSCs移植可能成为治疗HIBD的一种新途径,具有一定的临床应用前景。