龙藤汤促进胶原诱导性关节炎小鼠炎症消退的作用机制研究

来源 :北京中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Ryan
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目的:观察中药复方龙藤汤促进胶原诱导性关节炎(Collagen Induced Arthritis,CIA)小鼠炎症消退的作用效果,探讨龙藤汤调控CIA小鼠滑膜2型固有淋巴细胞(Type 2 Innate lymphoid cells,ILC2s)免疫应答的可能作用机制,为应用中医“正气亏虚、伏邪痹阻”理论治疗类风湿关节炎提供基础实验支撑,使之更好的适用于临床。方法:将32只雄性DBA/1小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组及龙藤汤组,每组8只。采用尾根部及背部多点注射牛Ⅱ型胶原蛋白(CalfⅡ collagen,CⅡ)乳化剂建立CIA小鼠模型。阳性药组给予来氟米特水溶液,龙藤汤组给予龙藤汤药液,正常组与模型组分别给予生理盐水,每日灌胃1次,连续28天。采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用仪(High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Mass Spectrometry,HPLC-ESI/MS)对龙藤汤中的药物化学成分进行鉴定。药物干预后每7天进行一次关节炎性评分,测量足跖关节肿胀厚度,观察小鼠足部红肿情况。28天后使用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉法处死小鼠并进行取材。取小鼠淋巴结和关节滑膜组织制备单细胞悬液,通过流式细胞仪检测外周血淋巴细胞悬液中幼稚T细胞(Naive T cell,Tn)、记忆 T 细胞(Memory T cell,Tm)、效应 T 细胞(Effector T cell,Te)、辅助性 T 细胞 17(Helper T cells 17,Th17)和调节性 T 细胞(Regulatory T cells,Treg)比率,以及滑膜组织细胞悬液中ILC2s比率,探讨龙藤汤对Tm、T17、Treg细胞和ILC2s的增殖分化的影响。取小鼠关节组织制备石蜡切片,通过苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色、番红O-固绿(Safranin O-Fast Green staining)染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphase,TRAP)染色观察小鼠关节滑膜组织炎症和骨质变化情况、软骨损伤程度以及破骨细胞分布变化;通过免疫荧光染色法观察病变组织中M1、M2型巨噬细胞的分布。通过蛋白免疫印迹法(Western-blot,WB)检测滑膜组织中酪氨酸激酶 2(Janus kinase 2,JAK2)、酪氨酸激酶 3(Janus kinase 3,JAK3)和信号传导及转录激活蛋白 6(Signal transducer and activator of transcription,STAT6)蛋白水平表达及其磷酸化水平,研究龙藤汤调控炎症相关信号转导通路分子作用机制;收集小鼠血清,通过酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中促炎细胞因子白介素-17(Interleukin 17,IL-17)、干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)和抑炎细胞因子白介素-4(Interleukin4,IL-4)含量的变化。结果:(1)药物成分析结果显示,HPLC-ESI/MS共鉴定出龙藤汤中19种主要化学成分。(2)关节炎性评分和足跖关节厚度结果显示,从第7天起,与模型组比较,龙藤汤组和阳性药组小鼠关节炎性评分显著降低(P<0.01),小鼠双侧足底关节肿胀厚度逐渐减小(P<0.01)。(3)病理染色结果显示,CIA模型组小鼠关节腔滑膜组织增生,大量炎症细胞浸润,破骨细胞增多,甚至多处软骨糜烂和软骨破坏。经龙藤汤和阳性药物治疗后,CIA小鼠病理炎症减轻,软骨破坏减少,破骨细胞的分化得到抑制。与模型组相比,各药物治疗组病理评分以及Safranin O染色缺失评分降低(P<0.05,P<0.01)。(4)流式结果显示,药物灌胃干预28天后,各药物组Tn细胞的比率显著降低(P<0.01),Te和Tm细胞的比率升高(P<0.05,P<0.01)。模型组与正常组比较,Th17细胞比率显著升高(P<0.01),Treg细胞和ILC2S细胞比率显著降低(P<0.01)。经过28天药物干预后,与模型组相比,各药物组Th17细胞比率显著降低(P<0.01),Treg细胞和ILC2S细胞比率显著升高(P<0.01)。(5)ELISA结果显示,药物灌胃干预28天后,与模型组相比,各药物组中的促炎细胞因子IL-17和IFN-γ的分泌减少(P<0.05,P<0.01),而抗炎细胞因子IL-4分泌明显增加(P<0.01)。(6)免疫荧光结果显示,模型组中巨噬细胞的分布以M1型为主,而龙藤汤治疗组和阳性药组巨噬细胞的分布以M2型为主。(7)WB结果显示,与模型组相比,阳性药组和龙藤汤组STAT6蛋白表达及其磷酸化水平均显著升高(P<0.01),阳性药组的JAK3蛋白的表达和龙藤汤组JAK3蛋白磷酸化水平均降低(P<0.05):阳性药组和龙藤汤组JAK2蛋白的表达及其磷酸化水平表达没有统计学差异(P>0.05);龙藤汤组的JAK3蛋白水平的表达以及阳性药组JAK3蛋白磷酸化水平也没有统计学差异(P>0.05)。结论:龙藤汤可以缓解CIA小鼠滑膜炎症,修复关节软骨损伤及减轻骨质破坏,减缓类风湿关节炎滑膜组织炎症进程。其主要机制可能与促进ILC2s的增殖与分化,促使巨噬细胞由M1型向M2型极化,抑制异常免疫应答,维持病变组织内环境免疫稳态有关。
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