【摘 要】
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钙、锌和二价铁是维护人体健康必不可少的矿物质元素。长期摄入不足,将会诱发代谢性骨病、免疫功能下降和缺铁性贫血等疾病的产生。传统金属离子补充剂存在易沉淀、受饮食结构影响和生物可及率低的缺点,肽-金属离子结合物作为一种新型的矿物质补充剂有望解决上述问题。油料和淀粉加工副产品中蛋白质含量丰富,通过酶解制备植物蛋白肽,开发金属离子结合肽,能实现对副产品的增值化利用。论文首先考察乙醇分级处理对于植物蛋白肽的
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钙、锌和二价铁是维护人体健康必不可少的矿物质元素。长期摄入不足,将会诱发代谢性骨病、免疫功能下降和缺铁性贫血等疾病的产生。传统金属离子补充剂存在易沉淀、受饮食结构影响和生物可及率低的缺点,肽-金属离子结合物作为一种新型的矿物质补充剂有望解决上述问题。油料和淀粉加工副产品中蛋白质含量丰富,通过酶解制备植物蛋白肽,开发金属离子结合肽,能实现对副产品的增值化利用。论文首先考察乙醇分级处理对于植物蛋白肽的组成及金属离子结合性质的影响,其次以醇溶大豆肽考察其与三种金属离子的结合差异,进一步分离纯化、鉴定并合成肽序,探究三种金属离子结合位点及结合模式差异,最后考察肽-金属离子结合物的性质,为其制备与产品开发提供理论基础。首先,考察乙醇分级处理对于植物蛋白肽的结构及金属离子结合性质的影响。采用Alcalase酶解植物源蛋白制备大豆肽(SPH)、核桃肽(WPH)、棉籽肽(CPH)和小麦肽(GPH),接着采用乙醇溶液(85%,v/v)分别对其进行分级处理获得醇溶肽。结果表明SPH、WPH、CPH和GPH醇溶肽得率分别为68.32%、59.33%、45.63%和96.96%;醇溶肽具有较低的相对分子质量(MW<2000的肽占79.51%~93.04%)、较高的疏水氨基酸含量(38.91%~43.63%),且具有较高的金属(钙、锌和铁)离子结合量。相关性分析发现,肽-钙结合物得率与肽的疏水氨基酸含量呈现负相关性,而肽-锌结合物得率与肽的疏水氨基酸含量呈现正相关性,而铁结合物得率与肽疏水氨基酸含量之间并不存在相关性。同时,Ca2+更易与1000<MW<2000的肽结合,而Zn2+和Fe2+更易与MW<1000的肽结合。其中醇溶大豆肽(SPH-Es)具有良好的金属离子结合能力(钙结合量93.34 mg/g、锌结合量118.05 mg/g和铁结合量99.49 mg/g)。其次,对醇溶大豆肽-金属离子结合物进行结构表征。醇溶大豆肽与金属离子结合后,酸性氨基酸(Glx和Asx)、碱性氨基酸(Lys、His和Arg)、Cys和Pro的含量显著提高。肽-钙结合物、肽-铁结合物中Glx分别为37.69%和39.76%;肽-锌结合物、肽-铁结合物中碱性氨基酸含量分别为18.59%和18.45%。内源性荧光光谱、紫外吸收光谱、红外光谱分析结果表明,金属离子与SPH-Es之间结合产生新的化合物,羧基氧原子和氨基氮原子是其主要的结合位点,肽键也参与结合反应,但不同官能团与金属离子之间存在结合偏好差异。透析实验进一步说明肽与Ca2+、Zn2+和Fe2+主要通过配位相互作用结合。随后,采用Sephadex G15与半制备RP-HPLC分离纯化SPH-Es,制备高金属离子结合量的组分,分离鉴定肽序并合成GDQEA和GDQDH肽段,进一步考察其与不同金属离子的结合方式。通过XPS、FTIR和~1H NMR研究两种纯肽与金属离子配体间的相互作用发现,肽段氨基酸组成对其结合具有显著性影响,金属离子与GDQEA的主链或侧链游离的羧基和氨基之间生成N-Meta和O-Metal化学键,形成双齿或α-结合模型;但GDQDH与金属离子配体间结合差异较为明显,Ca2+和Fe2+主要与Asp侧链基团上的羧基和氨基结合,形成N-Metal和O-Metal化学键,GDQDH与Zn2+之间仅通过O-Zn形成双齿结合模式,Ca2+和Zn2+不与His咪唑基上的N结合,但Fe2+能与之结合。肽段氨基酸序列组成显著地影响着Ca2+、Zn2+和Fe2+的结合位点与配位模式。最后,对醇溶大豆肽-金属离子结合物(Metal-SPH-Es)的理化特性进行了考察。金属离子配体与SPH-Es间结合提高了肽的热稳定性。Ca-SPH-Es在p H 2~8下具有78.65%~88.92%的金属溶解率和良好稳定性,Zn-SPH-Es在碱性条件下具有较差的稳定性,Fe-SPH-Es在p H 3~6内不易溶解且稳定性差。通过模拟胃肠道消化发现,Metal-SPH-Es在模拟胃液内发生一定程度的解离,并且随着胃胰酶的水解,分子量不断减少,同时金属结合量不断提高,Ca-SPH-Es、Zn-SPH-Es和Fe-SPH-Es的生物利用率分别可达91.27%、86.02%和85.60%。抗氧化性实验发现Metal-SPH-Es具有良好的DPPH自由基清除能力。测定Zeta电位发现Metal-SPH-Es表面电位减少。通过SEC-HPLC、粒径、SEM和变性剂处理实验,发现金属离子配体与SPH-Es结合后微观结构发生改变,Ca-SPH-Es通过氢键和疏水相互作用促使肽聚集现象的产生。
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