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小麦白粉病是由小麦白粉病菌（Blurmeria graminis f.sp.tritici,Bgt）引发的真菌性病害。抗白粉病基因Pm21来自小麦近源物种簇毛麦（Haynaldia villosa L.,2n=2x=14,基因组VV）,Pm21对目前国内所有小麦白粉菌生理小种表现免疫,具有抗性强、抗谱广的特点,本实验室创造的含Pm21的小麦-簇毛麦异易位系已经在我国小麦育种中广泛应用。克隆簇毛麦抗白粉病相关基因,明确Pm21基因介导的广谱抗白粉病分子机制,对于指导小麦抗白粉病分子改良具有重要意义。本实验室在前期研究中,利用基因芯片杂交技术,在簇毛麦中克隆了一个编码E3连接酶的基因Hv-CMPG1,转基因试验证明该基因在小麦抗白粉中发挥重要作用。为了鉴定Hv-CMPG1的互作蛋白,解析Hv-CMPG1介导的白粉病抗性分子通路,本研究构建了一个簇毛麦酵母双杂交文库,利用酵母双杂技术筛选、克隆其互作蛋白基因,研究其在抗白粉病中的功能。取得的主要研究进展如下:1.构建了 一个受白粉菌诱导前后簇毛麦叶片的核系统酵母双杂交cDNA文库,该文库包含50多万单克隆,平均插入cDNA片段大于200 bp。2.以Hv-CMPG1为诱饵,筛选酵母双杂交cDNA文库,鉴定出17个互作蛋白候选克隆。根据基因功能注释和互作强度,选择CMIN2进行进一步研究。结果表明,CMIN2克隆包含基因全长,其ORF为456 bp,编码151个氨基酸;对其编码蛋白进行 BLASTp比对发现,该蛋白属 HIPP（Heavy metal associated isoprenylated plant protein）类法尼化蛋白,其N端第37位氨基酸到第85位氨基酸之间有一个重金属结合域HMA,其C端有一个法尼化结构域CaaX,将该基因命名为HvHIPP1。3.系统进化分析结果表明,HvHIPP1和其在部分禾本科植物中的同源蛋白氨基酸相似性大于80%,HvHIPP1和粗山羊草中的EMT21257相似度最高,达98%;利用一套普通小麦-簇毛麦异染色体系进行染色体定位分析,将HvHIPP1定位在簇毛麦3VL FL:0.78-1.00区域。BLASTn分析发现,HIPP1同源基因分别位于大麦3H（303070633-303071577）、短柄草 3 号染色体（2936502-2937263）、乌拉尔图小麦 6AS1-0.35-0.65区段、水稻1号染色体（19382611-19414396）和高粱7号染色体（170550-171704）区域。4.利用pAN580-HlvHIPP1融合载体在洋葱表皮细胞中瞬间表达,进行亚细胞定位分析。结果显示,HvHIPP1蛋白定位在洋葱表皮细胞膜和细胞核上;为研究HvHIPP1的法尼化结构域对于其亚细胞定位和功能的影响,本研究构建了法尼化结构域点突变后的突变型HvHIPP1基因,将pAN580-HvHIPP1mn在洋葱表皮细胞中瞬间表达,发现突变蛋白HvHIPP1m无法在细胞膜上定位,表明法尼化结构域对于HvHIPP1蛋白的细胞膜上定位发挥关键作用。5.利用原核表达的MBP-Hv-CMPG1、GST-HvHIPP1融合蛋白进行Pull-down、体外泛素化实验和蛋白质体外降解实验,结果显示,Pull-down后,只有MBP-Hv-CMPG1和GST-HvHIPP1共同孵化时才能用GST抗体检测到GST-HvHIPP1融合蛋白,表明HvHIPP1和Hv-CMPG1蛋白在体外直接互作。体外泛素化实验发现,Western blot可以检测连接多个泛素的GST-HvHIPP1融合蛋白,表明HvHIPP1可以被Hv-CMPG1体外泛素化。蛋白质体外降解实验发现,MBP-Hv-CMPG1和GST-HvHIPP1共同孵化后不同时间点均能检测到GST-HvHIPP1融合蛋白,并且蛋白浓度基本一致,表明HvHIPP1不能被泛素-蛋白酶体系统降解。6.qRT-PCR结果表明,HvHIPP1表达具有组织表达特异性,在簇毛麦叶片和根中表达量比茎和幼穗中分别高7-13倍。受白粉菌诱导后,HvHIPP1基因在不同抗感材料中的表达存在差异,在簇毛麦叶片中45min开始上调表达,2h时表达量达到最大,然后缓慢降到诱导前水平;在硬簇麦叶片中,45min开始上调表达,在2h后表达量降到诱导前水平;在小麦-簇毛麦3V异附加系叶片中,HvHIPP1表达量也轻微上调,但延迟到24h;在中国春叶片中,HvHIPP1同源基因的表达量在6h轻微下调;在携带Pm21的小麦品种南农9918叶片中,HvHIPP1同源基因的表达不受白粉菌诱导变化。推测HvHIPP1参与了簇毛麦介导的抗白粉菌反应,受白粉菌诱导后其快速表达对于抗白粉病具有关键作用。7.利用基因枪法将野生型和突变型HvHIPP1基因在感白粉病小麦品种扬麦158叶片中瞬间表达,结果表明,单独在扬麦158叶片表皮细胞中过量表达GUS基因吸器指数为58.7%,过量表达HvHIPP1和GUS基因白粉菌的吸器指数降低到35.0%;而过量表达HvHIPP1m和GUS基因吸器指数降低到51.7%,和过量表达GUS基因相比差异不显著;表明HvHIPP1在小麦抗白粉病中发挥正向调控作用,其法尼化结构域对于该功能的发挥具有重要作用。利用VIGS（Virus induced gene silencing）技术沉默硬簇麦中的HvHIPP1基因,结果显示,HvHIPP1沉默后,硬簇麦叶片上有白粉菌孢子堆生成,组织学观察结果与表型鉴定结果一致。进一步利用基因枪法将HvHIPP1转化扬麦158,共获得190株T0代再生植株,其中35株鉴定为阳性转基因植株;苗期离体鉴定和成株期田间抗白粉病鉴定结果表明,其中5株表现高抗白粉病。进一步对T1代株系苗期抗白粉病离体鉴定,发现5个株系抗性均产生分离,分离比介于2:1-7:1之间;利用25个白粉菌生理小种对其中一个T2代株系HIPP-T2-2进行苗期白粉病抗性鉴定,发现该株系对14个生理小种表现高抗。利用基因枪法将突变基因HvHIPP1m转化扬麦158,获得89棵T0代再生植株,对其中2个T1代阳性株系苗期抗白粉病鉴定结果表明,其对白粉病的抗性和受体扬麦158相比无差异。以上研究结果证明HvHIPP1在小麦抗白粉病中发挥重要正向调控作用,而其法尼化结构影响其在抗白粉病中的功能。8.簇毛麦叶片中,发现HvHIPP1受ABA、ET、MeJA和H202诱导后均表现快速上调表达,但外源SA处理后HvHIPP1基因表达量不变。分析稳定的过量表达HvIPP1转基因植株和HvHIPP1沉默植株抗病通路基因表达特征,发现HvHIPP1可正向调控SA和H2O2通路相关基因的表达。因此,推测HvHIPP1基因的表达受ABA、ET、JA和H2O2信号分子调控,但不受SA调控,HvHIPP1可能通过调控SA和H2O2介导的信号通路,提高小麦对白粉菌的抗性。