日本血吸虫病是一种严重危害人类健康的寄生虫病,具有感染率高,复发性强等特点。目前对血吸虫疾病的预防和治疗主要是通过消灭钉螺和药物吡喹酮化疗来实现的,但效果并不是很理想。当今疫苗已成为控制和治疗传染病的一种有力武器,因此高效、廉价的日本血吸虫疫苗的研制具有很强的经济价值和社会意义。毕赤酵母和转基因植物作为真核表达系统,用于生产疫苗均具有廉价、安全和有效等优点,已成为目前研究的热点。本实验通过分子生物学手段,分别建立了Sj23抗原基因的毕赤酵母和紫花苜蓿表达系统,以期望获得日本血吸虫蛋白质疫苗和可食用性植物疫苗。目前已取得了如下成果:(1)通过PCR扩增获得Sj23基因,构建了酵母表达载体pPIC9K-Sj23,对其进行了双酶切和测序验证,测序结果与登录号为M63706的日本血吸虫抗原基因序列同源性为99%,表明已成功构建酵母表达载体pPIC9K-Sj23。(2)通过LiCl法将重组酵母表达载体pPIC9K-Sj23转化到毕赤酵母GS115中,获得转化子。对所得阳性转化子进行PCR筛选,得到酵母重组菌株。将得到的酵母重组菌株进行甲醇诱导,发酵表达Sj23蛋白。取发酵上清进行SDS-PAGE分析,可获得Sj23表达的23KDa蛋白质条带,表明Sj23基因已成功转入毕赤酵母中并可表达。(3)在摇瓶水平上,对重组菌株诱导发酵条件进行了初步优化,得出以1.0%甲醇为诱导物,在30℃培养时的最适诱导时间为72 h,最适诱导pH为5.0。(4)通过农杆菌介导的方法将LBA4404(含pCAMBIA1303-Sj23)转化入紫花苜蓿外植体,利用直接器官发生的方法,采用MS+2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA的激素组合诱导生芽,再使用50 mg/L的Hyg进行筛选得到抗性再生芽,最后在1/2 MS培养基上诱导生根得到再生植株。(5)提取再生植株的基因组DNA进行PCR验证,初步证明Sj23基因已整合到植物基因组中。