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灸法是传统中医药疗法的重要组成部分，艾灸镇痛在中医学中已有数千年的历史。中医临床实践证明，艾灸疗法在缓解和消除疼痛方面具有良好的疗效。课题组长期从事肠腑病症的临床与基础研究，发现消化系统疾病，如肠易激综合征、溃疡性结肠炎、克罗恩病等患者均伴有程度不一的腹痛症状，艾灸疗法能有效缓解患者腹痛，具有镇痛效应。但艾灸缓解慢性内脏痛的镇痛机制一直未得到系统阐明，引起我们的思考。
慢性内脏痛的形成与发展机制复杂，“脊髓背角”在内脏伤害性刺激的传递和调控中起着至关重要的作用。资料表明，在外周疼痛刺激下，机体的内源性抗痛系统和致痛系统均被激活，在脊髓，内源性阿片肽及相应受体，P物质(SP)、谷氨酸(Glu)等多种神经递质参与了慢性痛敏过程。针刺镇痛的研究表明，电针主要是通过激活内阿片肽系统及其他内源性镇痛物质来完成的，同时对内源性致痛物质(SP、Glu)也有抑制作用。那么，临床上，同样作为体表刺激疗法的艾灸疗法获得镇痛效应是否亦与激活脊髓水平阿片肽系统、抑制内源性致痛物质相关呢?
目的
本研究以“合募配穴”中医针灸理论为指导，以大肠下合穴-上巨虚、大肠募穴-天枢为代表，以温和灸为干预手段，选择IBS慢性内脏痛大鼠模型为研究对象，采用行为学与形态学相结合，观察c-fos在IBS慢性内脏痛大鼠脊髓背角的表达及温和灸对其的影响，探讨“脊髓”是否参与艾灸镇痛过程；观察鞘内注射纳洛酮对艾灸镇痛效应的影响，探讨脊髓水平阿片肽系统是否参与艾灸镇痛过程；观察鞘内注射强啡肽或/和κ受体特异性拮抗剂对慢性内脏痛大鼠痛阈及艾灸镇痛的影响，观察温和灸对脊髓水平强啡肽、κ受体的影响，探讨艾灸是否通过激活脊髓水平强啡肽系统实现镇痛作用；进一步观察艾灸干预或/和鞘内注射强啡肽对脊髓水平SP、Glu表达的影响，从脊髓阿片肽系统初步阐释艾灸镇痛机制。
研究分为4个部分：
1.采用乳鼠结直肠扩张(colorectal distention, CRD)刺激建立IBS慢性内脏痛大鼠模型，随机将大鼠分为正常组、模型组、艾灸组、假艾灸组。艾灸组与假艾灸组大鼠从出生后第36天开始分别接受温和灸双侧天枢、上巨虚穴，假灸双侧天枢、上巨虚穴干预，每天1次，每次每穴10min，共7天。在全部干预结束后30-90分钟内行CRD刺激，采用腹部撤回反射(Abdominal withdraw reflex，AWR)评分作为检测内脏痛的行为学指标，观察温和灸对IBS慢性内脏痛大鼠的镇痛效应。剪取长约1cm结肠组织(离肛门5cm处开始)，采用HE染色法观察降结肠局部组织病理学变化，判断模型是否属于功能性慢性内脏痛模型；剪取L6-S1脊髓节段，采用免疫组织化学的方法，观察脊髓背角Fos蛋白的表达及温和灸对其的影响。
2.大鼠随机分为正常组、模型组、艾灸组、鞘内注射纳洛酮组+艾灸组(i.t.Naloxone+艾灸组)、鞘内注射生理盐水组+艾灸组(i.t.NS+艾灸组)。艾灸组干预方法同第一部分。i.t.Naloxone+艾灸组、i.t.NS+艾灸组大鼠，在每次艾灸干预前15min分别给予i.t.Naloxone、i.t.NS，每天1次，共7天。采用行为学的方法，观察鞘内注射纳洛酮对艾灸镇痛效应的影响。
3.大鼠随机分为正常组、模型组、鞘内注射强啡肽组(i.t.Dyn组)、鞘内注射生理盐水组(i.t.NS组)、鞘内注射κ受体特异性拮抗剂组(i.t.nor-BNI组)、i.t.Dyn+nor-BNI组。i.t.Dyn组、i.t.NS组、i.t.nor-BNI组、i.t.Dyn+nor-BNI组大鼠，于大鼠出生后第36天分别给予鞘内注射Dyn、NS、nor-BNI、Dyn+nor-BNI。采用行为学的方法，观察鞘内注射强啡肽或/和κ-受体拮抗剂对慢性内脏痛大鼠痛阈的影响；大鼠随机分为正常组、模型组、艾灸组、i.t.nor-BNI+艾灸组、i.t.nor-BNI组、i.t.Dyn组、i.t.Dyn+艾灸组。艾灸组干预方法同第一部分。i.t.nor-BNI+艾灸组、i.t.Dyn组+艾灸组大鼠，于每次艾灸干预前15min分别给予鞘内注射nor-BNI、Dyn，每天1次，共7天；i.t.nor-BNI、i.t.Dyn组大鼠每天同一时间分别给予鞘内注射nor-BNI、Dyn，每天1次，共7天。采用行为学的方法，观察鞘内注射强啡肽或/和κ受体拮抗剂对艾灸镇痛效应的影响。大鼠随机分为正常组、模型组、艾灸组、假艾灸组，采用原位杂交的方法观察L6-S1脊髓节段前强啡肽原(PPD)mRNA、κ受体mRNA的表达；采用免疫组织化学的方法观察相应脊髓节段Dyn的表达：采用酶联免疫检测法检测相应脊髓节段Dyn的浓度。
4.大鼠随机分为正常组、模型组、艾灸组、假艾灸组。采用免疫组织化学的方法，观察L6-S1脊髓节段SP、Glu在IBS慢性内脏痛大鼠的表达及温和灸或/和鞘内注射强啡肽对其的影响。
结果
1.温和灸的镇痛效应观察及对IBS慢性内脏痛大鼠脊髓c-fos表达的影响
1.1各组大鼠体重的比较
与正常组相比，模型组、艾灸组、假艾灸组大鼠体重降低(P＜0.01，P＜0.05)；与模型组相比，艾灸组大鼠体重增加(P＜0.01)；模型组与假艾灸组大鼠体重的差异无统计学意义。
1.2各组大鼠降结肠局部组织HE染色观察
HE镜检结果显示，各组大鼠肠壁分层清楚，结肠黏膜结构完好，未见明显组织缺损，腺体排列整齐，间质无明显充血、水肿、炎细胞浸润等，黏膜下层未见明显异常改变。
1.3各组大鼠慢性内脏痛的行为学评分结果
各组大鼠对不同强度(20、40、60、80mmHg)的CRD刺激敏感性不同，随着刺激强度的增加，各组大鼠AWR评分增加。与正常组相比，模型组大鼠AWR评分明显上升(P＜0.01)；与模型组相比，艾灸组大鼠AWR评分明显下降(P＜0.01)；假艾灸组与模型组大鼠AWR评分的差异无统计学差异。
1.4温和灸对IBS慢性内脏痛大鼠脊髓背角c-fos表达的影响
各组大鼠脊髓背角Fos阳性表达总面积与OD值经单因素方差分析，差异均具有统计学意义(P＜0.001)。组间比较显示，与正常组相比，模型组大鼠Fos阳性表达总面积与OD值均增加，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组相比，艾灸组大鼠Fos阳性表达总面积与OD值降低(P＜0.05)，假艾灸组与模型组比较，差异无统计学意义。
2.鞘内注射纳洛酮对艾灸镇痛效应的影响
随着CRD刺激强度的增加，各组大鼠AWR评分上升。在不同强度(20、40、60、80mmHg)的内脏痛诱发刺激下，与正常组大鼠相比，模型组AWR评分明显上升(P＜0.01)；与模型组相比，艾灸组大鼠AWR评分降低(P＜0.01)；与艾灸组相比，i.t.Naloxone+艾灸组大鼠AWR评分升高(P＜0.01，P＜0.05)；艾灸组与i.t.NS+艾灸组大鼠AWR评分的差异无统计学意义。在20、40、60mmHg强度的内脏痛诱发刺激下，与模型组相比，i.t.Naloxone+艾灸组大鼠AWR评分降低(P＜0.01)。
3.脊髓水平强啡肽系统在IBS大鼠慢性内脏痛及艾灸镇痛中的作用及机制研究
3.1 i.t. Dyn对慢性内脏痛大鼠痛阈的影响
在不同强度(20、40、60、80mmHg)的内脏痛诱发刺激下，与正常组大鼠相比，模型组AWR评分明显上升(P＜0.01)；与模型组相比，i.t.Dyn组大鼠AWR评分降低(P＜0.01)，模型组与i.t.NS组比较，差异无统计学意义。
3.2 i.t.nor-BNI对Dyn镇痛作用的影响
在不同强度(20、40、60、80mmHg)的内脏痛诱发刺激下，与模型组相比，i.t.NS、i.t.nor-BNI对大鼠痛阈无影响；与i.t.Dyn组相比，i.t.Dyn+nor-BNI组大鼠AWR评分升高(P＜0.05)；模型组与i.t.Dyn+nor-BNI组大鼠AWR评分的差异无统计学差异。
3.3在IBS慢性内脏痛大鼠模型上，i.t.nor-BNI对艾灸镇痛的影响
在不同强度(20、40、60、80mmHg)的内脏痛诱发刺激下，与正常组相比，模型组大鼠AWR评分明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，艾灸组大鼠AWR评分降低(P＜0.01)；模型组与i.t.nor-BNI组相比，大鼠AWR评分无统计学差异。在20、60、80mmHg强度刺激下，与艾灸组相比，艾灸+i.t.nor-BNI组大鼠AWR评分明显升高(P＜0.01)。在40mmHg强度刺激下，与艾灸组相比，艾灸+i.t.nor-BNI组大鼠AWR评分升高，但差异无统计学意义。
3.4在IBS慢性内脏痛大鼠模型上，i.t.Dyn对艾灸镇痛的影响
与模型组相比，i.t.Dyn组、艾灸组大鼠AWR评分下降(P＜0.01，P＜0.05)。在40mmHg强度的CRD刺激下，艾灸+i.t.Dyn组大鼠AWR评分低于i.t.Dyn组、艾灸组，但差异无统计学意义。在60mmHg强度的CRD刺激下，与艾灸组相比，艾灸+i.t.Dyn组大鼠AWR评分降低(P＜0.01)。在80mmHg强度的CRD刺激下，与i.t.Dyn组相比，艾灸+i.t.Dyn组大鼠AWR评分降低(P＜0.05)。
3.5温和灸对IBS慢性内脏痛大鼠脊髓背角前强啡肽原(PPD)mRNA表达的影响
各组大鼠脊髓背角PPD mRNA阳性表达总面积与OD值经单因素方差分析，差异具有统计学意义(P＜0.001)。组间比较显示，与正常组相比，模型组大鼠PPDmRNA阳性表达总面积与OD值均明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组相比，艾灸组大鼠脊髓背角PPDmRNA阳性表达总面积与OD值均升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；假艾灸组与模型组相比，差异无统计学意义。
3.6温和灸对IBS慢性内脏痛大鼠脊髓背角Dyn表达的影响
各组大鼠脊髓背角Dyn阳性表达总面积与OD值经单因素方差分析，差异具有统计学意义(P＜0.001)。组间比较显示，与正常组相比，模型组大鼠Dyn阳性表达总面积与OD值均升高，差异有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05)；与模型组相比，艾灸组大鼠脊髓背角Dyn阳性表达总面积与OD值均升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；假艾灸组与模型组相比，差异无统计学意义。
3.7温和灸对IBS慢性内脏痛大鼠脊髓Dyn含量的影响
与正常组大鼠相比，模型组大鼠脊髓Dyn浓度升高(P＜0.05)；与模型组相比，艾灸组大鼠脊髓Dyn浓度升高(P＜0.05)；模型组与假灸组大鼠脊髓Dyn浓度比较，差异无统计学意义。
3.8温和灸对IBS慢性内脏痛大鼠脊髓κ受体mRNA表达的影响
与正常组相比，模型组大鼠κ受体mRNA阳性表达总面积与OD值升高(P＜0.05)。艾灸干预后，κ受体mRNA阳性表达总面积与OD值进一步升高(P＜0.05)。
4.温和灸或/和鞘内注射强啡肽对慢性内脏痛大鼠脊髓背角SP、Glu表达的影响
4.1温和灸或/和鞘内注射强啡肽对IBS慢性内脏痛大鼠脊髓背角SP表达的影响
各组大鼠脊髓背角SP阳性表达总面积与OD值经单因素方差分析，差异有统计学意义(P＜0.001)。组间比较显示：与正常组比较，模型组大鼠脊髓背角SP阳性表达总面积与OD值显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，i.t.Dyn组大鼠脊髓背角SP阳性表达总面积与OD值降低(P＜0.05)，艾灸组大鼠SP阳性表达总面积与OD值降低(P＜0.01，P＜0.05)，i.t.Dyn+艾灸组大鼠SP阳性表达总面积与OD值降低(P＜0.001，P＜0.01)，假艾灸组与模型组比较，差异无统计学意义。
4.2温和灸或/和鞘内注射强啡肽对IBS慢性内脏痛大鼠脊髓背角Glu表达的影响
各组大鼠脊髓背角Glu阳性表达总面积与OD值经单因素方差分析，差异具有统计学意义(P＜0.001)。组间比较显示：模型组大鼠脊髓背角Glu阳性表达总面积与OD值均显著高于正常组(P＜0.01)；与模型组比较，i.t.Dyn组大鼠Glu阳性表达总面积与OD值降低(P＜0.05，P＜0.01)，艾灸组Glu阳性表达总面积与OD值降低(P＜0.05)，i.t.Dyn+艾灸组大鼠Glu阳性表达总面积与OD值降低(P＜0.001，P＜0.01)，假艾灸组与模型组比较，差异无统计学意义。
结论
1.温和灸天枢、上巨虚穴缓解IBS慢性内脏痛的镇痛效应与抑制L6-S1脊髓节段相关神经元对传入的内脏伤害性刺激的反应有关；“脊髓”参与了IBS慢性内脏痛及艾灸镇痛过程。
2.温和灸的镇痛作用能被预先鞘内注射一定剂量的纳洛酮部分阻断，提示脊髓水平阿片肽系统参与艾灸缓解IBS慢性内脏痛的过程。
3.鞘内注射一定剂量的强啡肽可通过κ受体缓解慢性内脏痛的作用；艾灸镇痛作用能被鞘内注射κ受体特异性拮抗剂部分阻断，且能被鞘内注射强啡肽加强，提示脊髓水平强啡肽系统参与艾灸镇痛过程。温和灸促进慢性内脏痛大鼠L6-S1脊髓节段强啡肽的合成、κ受体mRNA的表达，提示温和灸天枢、上巨虚穴能通过激活脊髓水平强啡肽系统是实现镇痛作用。
4.鞘内注射强啡肽及温和灸干预都能降低IBS慢性内脏痛大鼠脊髓背角SP、Glu的表达，温和灸与鞘内注射强啡肽合用，SP、Glu表达进一步降低。提示温和灸缓解IBS慢性内脏痛与其减少伤害性递质SP、Glu的表达有关；鞘内注射强啡肽缓解IBS慢性内脏痛与其减少伤害性递质SP、Glu的表达有关。
5.温和灸天枢、上巨虚穴在脊髓水平能够激活强啡肽系统，抑制SP、Glu的释放，结合文献资料，我们推测在IBS慢性内脏痛大鼠，艾灸可能通过突触前抑制机制实现镇痛效应，脊髓强啡肽、κ受体、SP、Glu参与其过程。