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研究背景和研究目的:肺癌和慢性阻塞性肺炎(COPD)是影响人类生活质量的全球性健康问题，发病率呈现逐年增加的趋势，上皮细胞-间质细胞转变(EMT)是COPD和肺癌的重要病理生理过程。我们推测吸烟可能是引起EMT的重要因素。香烟含有大量的氧化物质，这些氧化物质能激活Rac1。Rac1是Rho家族中的一种小G蛋白，其影响细胞的生存、迁移、骨架重排和代谢，并且Rac1的敲除能够有效地抑制细胞的迁移和侵袭。虽然有研究证明Rho信号途径在TGF-β1所诱导的迁移中的作用，以及Smad信号在EMT的调控作用，但是有关Rac1在香烟诱导的EMT中的调节作用，则尚未见有报道。因此，本课题就香烟能否诱导EMT及诱导过程的关键因子和信号途径加以研究。
方法:
1) MTT法检测CSE对A549细胞活性的影响;
2)用CSE诱导EMT，用Q-PCR、Elisa、western blot、细胞免疫荧光染色等方法测定EMT指标如转移生长因子(TGF-β1)、金属基质蛋白酶-9(MMP-9)、α-肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白(vimentin)，和显微镜检测细胞形态;
3)用抗TGF-β1中和抗体(ATNA)阻断TGF-β1与其Ⅱ型受体相结合，确认TGF-β信号通路在CSE诱导的EMT中的作用;
4)采用Rac活性试验检测CSE对Rac1信号分子的影响，接下来用Rac1的抑制剂(NSC23766，NSC)抑制Rac1的活性或Rac1 siRNA沉默Rac1基因，来探究Rac1在CSE诱导的EMT中的作用;
5) NSC抑制Rac1的活性或Rac1 siRNA沉默Rac1基因后，采用westem blot法来检测Rac1对CSE诱导的Akt、Smad2以及P38活性的影响;
6)用PI3K的抑制剂(LY294002)和Akt的抑制剂(MK-2206)分别抑制PI3K和Akt的活性以及Erk1/2抑制剂(U0126)、JNK抑制剂(SP600125)、p38抑制剂(SB203580)阻断Erk1/2、JNK和P38，进一步研究CSE诱导EMT的信号机制。
结果:
1)细胞活力检测:不同浓度的CSE(0.1％～3％)与肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)培养24、48、72小时，呈浓度和时间依赖引起A549细胞毒反应和减少细胞的存活率;
2) CSE诱导肺上皮细胞TGF-β1的表达:不同浓度的CSE(0.1％～2.5％)刺激A549细胞24、48、72小时，Q-PCR和Elisa检测发现CSE呈浓度和时间依赖诱导肺上皮细胞表达TGF-β1，CSE暴露刺激48小时，可导致细胞形态发生改变、EMT相关因子的表达变化，并且低浓度的CSE和低浓度的TGF-β1联合处理细胞时可以协同诱导EMT现象;
3)用ATNA阻断TGF-β1与其Ⅱ型受体相结合，能抑制CSE诱导的EMT相关因子的表达变化（抑制E-cadherin表达的下调以及TGF-β1、vimentin、α-SMA表达的上调），这些数据证实CSE诱导EMT通过TGF-β1的聚集及其下游信号通路的激活;
4) ATNA/NSC可阻断CSE诱导的Rac1的激活，这显示CSE激活Rac1依赖于TGF-β1的聚集，并且抑制Rac1的活性或其表达可显著抑制CSE诱导的EMT现象;
5) CSE呈浓度依赖性诱导Akt的磷酸化，抑制Rac1活性或者其表达可抑制CSE诱导的Akt、Smad2的激活，但对P38的磷酸化无明显影响。PI3K和Akt的抑制剂能显著抑制EMT相关因子的表达变化，而MEK、P38、JNK抑制剂不能抑制这种现象。
结论:
综上结果提示，CSE刺激人的肺上皮细胞可引起EMT形态学和相关因子的变化与增加TGF-β1表达直接相关，siRac1干预和Rac1抑制剂处理可减少TGF-β1表达，也能抑制Akt、Smad信号途径，提示Akt/Smad2是Rac1的下游分子。我们的研究表明Rac1可能是治疗COPD和肺癌纤维化的潜在靶点，有待于我们在Rac1基因敲除小鼠模型上进一步深入研究。