论文部分内容阅读
目的：宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，其发病率占女性生殖系统恶性肿瘤的首位。晚期患者手术难以根治，放疗、化疗效果不理想，因此，提高化疗药物的敏感性，诱导肿瘤细胞凋亡成为改善晚期宫颈癌患者生活质量的有效措施。Survivin基因是近年来发现的一种细胞凋亡抑制基因，它位于17q25，是IAP基因家族(inhibitorofapoptosisproteins)中的一员，它在人和鼠的胚胎和胎儿期及肿瘤组织中高度表达，而在正常分化成熟组织中几乎不表达。研究证实Survivin基因的高表达与宫颈癌细胞的高耐药性密切相关。因此，抑制Survivin基因表达有可能提高宫颈癌细胞对化疗药物的敏感性，该基因有望成为宫颈癌基因治疗的靶点。RNA干扰作为近年来发现的一种高效的，广泛存在的，具有序列特异性的转录后水平的基因沉默过程。本研究利用RNAi技术抑制宫颈癌Hela细胞株Survivin基因，观察Hela细胞株的细胞凋亡、Survivin蛋白表达，及对顺铂药物敏感性的变化，为宫颈癌的基因治疗提供实验依据。
方法：以培养的宫颈癌Hela细胞株为体外研究模型，设三组进行实验：脂质体组，对照组，RNAi组。脂质体组为脂质体2000转染；对照组为pSilencerneosiRNAExpressionVectorkit中附带的阴性对照，载体内插入的片段为与人、鼠、兔的己知序列完全不相关的序列；RNAi组：利用文献提供的目标序列构建抑制Survivin表达的RNAi载体(pSSURV)，并转染Hela细胞。(1)半定量RT-PCR检测SurvivinmRNA，Westernblot法检测Survivin蛋白在脂质体组、对照组、RNAi组中的表达情况。(2)MTT法进行DDP对各组细胞存活率作用浓度分析：转染细胞24小时后，分别以如下浓度：0、0.05、0.25、1、5、10mg/L的DDP(山东齐鲁制药厂)进行药物作用浓度分析。(3)流式细胞术进行DDP对脂质体组、对照组、RNAi组各组细胞周期及细胞凋亡率的影响分析。
结果：(1)RT-PCR检测结果显示，3条泳道中GAPDH扩增条带(360bp)的亮度相似；而Survivin扩增条带(206bp)的亮度差异显著，RNAi组明显弱于脂质体组及对照组。用上海复日Smartview凝胶成像分析软件分析各扩增条带产物的Survivin/GAPDH的比值，脂质体组，对照组，RNAi组分别为0.86±0.10，0.82±0.08，0.23±0.05，RNAi组SurvivinmRNA相对含量较脂质体组明显下降，差异有统计学意义(P＜0.01)。(2)Westernblot检测各实验组Survivin蛋白表达情况，三组细胞裂解后各100ug蛋白样品，经电泳，转膜，抗体杂交，显色成像后，脂质体组与对照组Survivin蛋白条带明显存在，且基本一致，而RNAi组同样位置的条带基本消失。三组细胞的β-actin条带强度基本一致。说明RNAi组中，Survivin的蛋白表达明显受到抑制。(3)流式细胞术：RNAi转染组转染36小时后，细胞凋亡率明显高于脂质体组与阴性对照组；RNAi转染组细胞阻滞在G0/G1期，G/M期减少，与观察组和脂质体组分别比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。(4)MTT比色法检测结果显示，不同浓度顺铂处理后脂质体组的细胞存活率分别为(100±1.9)﹪、(68.3±2.3)﹪、(53.7±1.5)﹪、(50.1±1.8)﹪、(40.2±0.6)﹪、(35.3±2.3)﹪，对照组(97.4±1.7)﹪、(65.1±1.9)﹪、(51.8±1.7)﹪、(54.4±2.1)﹪、(40.5±1.4)﹪、(33.9±2.4)﹪,，RNAi组(98.1±2.3)﹪、(60.6±2.5)﹪、(35.2±1.5)﹪、(21.8±1.4)﹪、(24,9±1.9)﹪(18.7±2.6)﹪。脂质体组，对照组，RNAi组的IC50分别为(0.298±0.035)、(0.147±0.031)、(0.012±0.001)，RNAi组Hala细胞对顺铂的药物敏感性增高。两者比较，差异有统计学意义(P=0.000)。
结论：以培养的宫颈癌Hela细胞株为实验材料，研究RNAi抑制Survivin基因表达对提高宫颈癌Hela细胞药物敏感性的效应。结果发现：
RNAi明显抑制Survivin在转录及翻译水平的表达；
RNAi抑制Survivin的表达，能够明显提高宫颈癌Hela细胞株对DDP的药物敏感性，其效应具有浓度及时间依赖性，低浓度DDP即可达到有效杀伤效果。
本研究结果提示通过利用RNA干扰技术抑制凋亡相关基因的表达，能够增强肿瘤细胞对药物作用的敏感性，从而为药物不敏感肿瘤细胞的治疗提供有价值的思路，为提高宫颈癌的化疗效果提供了一定的理论基础。