论文部分内容阅读
[摘 要]目的：探讨凝血酶诱导过表达PAR1和干涉PAR1的人巨细胞性肺癌细胞的研究。方法：利用胶原重塑实验研究人巨细胞性肺癌细胞系对细胞外基质的重塑能力，蛋白免疫印迹检测PAR1和p53的蛋白表达量。结果：高表达PAR1的PLA-801C人巨细胞性肺癌细胞胶原重塑能力有了显著增强，干涉PAR1的PLA-801D人巨细胞性肺癌细胞胶原重塑能力明显减弱，且该细胞内PAR1与p53的蛋白表达量成反相关。结论：PAR1在凝血酶促进的人巨细胞性肺癌细胞的细胞外基质重塑功能中发挥着重要作用，且与p53的蛋白表达成反相关。
[关键词]PAR1；p53；凝血酶；人巨细胞性肺癌细胞
中图分类号：Q813 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2018）05-0342-01
PAR1（蛋白酶活化受体1）是最早被发现的凝血酶受体。它是由425个氨基酸组成，氨基端位于胞外，羧基端位于胞内，有七个跨膜区[1]。p53（肿瘤抑制蛋白）是一种分子质量为53KD的蛋白质，是肿瘤抑癌基因中特别重要的一种基因。它位于人类17号染色体上，野生型p53蛋白是由393个氨基酸组成，并包含了4个功能域[2]。随着对PAR1研究的逐渐深入，研究发现PAR1参与肺癌细胞的整个发展过程。本文主要研究凝血酶是否通过PAR1促使PLA-801C和PLA-801D人巨细胞性肺癌细胞的功能发生变化？凝血酶激活人巨细胞性肺癌细胞中的PAR1后是否通过胞内p53分子影响细胞功能？
1.材料与方法
1.1 细胞
过表达PAR1的PLA-801C人巨细胞性肺癌细胞和干涉PAR1的PLA-801D人巨细胞性肺癌细胞均由军事医学科学院放射与辐射研究所赠与。
1.2 实验主要试剂
RPMI 1640购于美国Gibco公司；鼠抗人p53抗体为Cell Signaling Technology公司产品；BCA法蛋白定量试剂盒为Thermo公司产品；其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.3 实验仪器
CO2细胞培养箱、离心机均为Thermo公司产品；半干转膜仪、湿转转膜仪购自美国BIO-RAD公司。
1.4 方法
1.4.1 细胞胶原收缩实验
实验分为对照组、凝血酶组。将PLA-801D-pSilence、PLA-801D- pSilence-shPAR1细胞用无血清培养基培养12h过夜，处理后调整细胞浓度为1×106个/ml，每组均做2个复孔。对照组，250μl细胞悬液加500μl鼠尾胶原；凝血酶组，250μl细胞悬液中加入终浓度为0.5U/ml的凝血酶，与500μl鼠尾胶原混匀，再置于3ml无血清培养基中，室外放置0.5h，使其胶原多聚化，然后再放置CO2细胞培养箱中孵育2周并观察，测量胶原直径。
1.4.2 蛋白免疫印迹（Western blot）
实验分为2组：对照组、凝血酶组。将PLA-801D- pSilence、PLA-801D-pSilence-shPAR1和PLA-801C-pIRES-EGFP、PLA-801C- pIRES-EGFP- PAR1细胞均饥饿12h，然后对照组继续饥饿24h，凝血酶组用0.5U/ml凝血酶处理24h。通过蛋白免疫印迹法（中国药典查询步骤）检测。
2.实验结果
2.1 凝血酶通过PAR1促进PLA-801D人巨细胞性肺癌细胞胶原的收缩
如图1结果所示，由A、C图可知当加入凝血酶后，PLA-801D人巨细胞性肺癌细胞对鼠尾胶原的收缩作用明显增强（p<0.01）；由B、D图可知，当PAR1干涉后，加入凝血酶后，PLA-801D人巨细胞性肺癌细胞对鼠尾胶原的收缩作用有所减弱（p﹥0.05）。
2.2 凝血酶对PAR1过表达和干涉的人巨细胞性肺癌细胞内p53表达的影响
如图2（A、B）结果所示，0.5U/ml凝血酶刺激PLA-801D和PLA-801C人巨细胞性肺癌细胞后，p53蛋白表达量下调，且与PAR1蛋白表达量成反相关。
4.讨论
从图1中，我们研究发现，当用加入1U/ml凝血酶时，PLA-801D-Psilence细胞有促进胞外基质胶原收缩的作用，而在PAR1被干涉后，PLA-801D-Psilence-shPAR1细胞对胞外基质胶原收缩的作用明显不如PLA-801D-Psilence细胞，这就说明了凝血酶可以通过PAR1来促进人巨细胞性肺癌细胞对细胞外基质的重塑，从而促进肿瘤的侵袭、转移和粘附。
为了探讨其机制，我们又检测了PLA-801D-pSilence、PLA-801D-pSilence-shPAR1和PLA-801C-pIRES-EGFP、PLA-801C-pIRES-EGFP-PAR1细胞株中的p53蛋白表达情况。0.5U/ml凝血酶刺激PLA-801D和PLA-801C人巨细胞性肺癌细胞后，p53蛋白表达量下调，且与PAR1蛋白表达量成反相关（图2A、B）。
5.结论与展望
凝血酶可以通过PAR1促进人巨细胞性肺癌细胞对胞外基质的重塑作用，这说明PAR1在人巨细胞性肺癌细胞的重塑功能中发挥着重要作用。同时，研究还发现PAR1与p53的蛋白表达量成反相关，且凝血酶还可以通过PAR1下调p53，但凝血酶是否唯一通过PAR1来调节p53影响人巨细胞性肺癌细胞的发生发展，尚不确定，仍需要進一步证明。
参考文献
[1] 李轩，谢立群.PARs与消化系肿瘤关系的研究进展[J].世界华人消化杂志2009年7月，17（21）：2179-2183.
[2] Peters AM，Kohfink B，Martin H，et al.Defective apoptosis due to a point mutation in the death domain of CD95 associated withautoimmune lymphoproliferative syndrome，T-cell lymphomaa and Hodgkin’ s disease[J].SO Exp Hematol，1999，27 （ 5）：8682874.
作者简介
何子阳（1986-）男，硕士，讲师，大庆广播电视大学。研究方向：远程教学，生物医学工程，163311。
迟玥（1986-），女，硕士，中级，研究方向：临床医学检验。大庆油田总医院，163311。
[关键词]PAR1；p53；凝血酶；人巨细胞性肺癌细胞
中图分类号：Q813 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2018）05-0342-01
PAR1（蛋白酶活化受体1）是最早被发现的凝血酶受体。它是由425个氨基酸组成，氨基端位于胞外，羧基端位于胞内，有七个跨膜区[1]。p53（肿瘤抑制蛋白）是一种分子质量为53KD的蛋白质，是肿瘤抑癌基因中特别重要的一种基因。它位于人类17号染色体上，野生型p53蛋白是由393个氨基酸组成，并包含了4个功能域[2]。随着对PAR1研究的逐渐深入，研究发现PAR1参与肺癌细胞的整个发展过程。本文主要研究凝血酶是否通过PAR1促使PLA-801C和PLA-801D人巨细胞性肺癌细胞的功能发生变化？凝血酶激活人巨细胞性肺癌细胞中的PAR1后是否通过胞内p53分子影响细胞功能？
1.材料与方法
1.1 细胞
过表达PAR1的PLA-801C人巨细胞性肺癌细胞和干涉PAR1的PLA-801D人巨细胞性肺癌细胞均由军事医学科学院放射与辐射研究所赠与。
1.2 实验主要试剂
RPMI 1640购于美国Gibco公司；鼠抗人p53抗体为Cell Signaling Technology公司产品；BCA法蛋白定量试剂盒为Thermo公司产品；其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.3 实验仪器
CO2细胞培养箱、离心机均为Thermo公司产品；半干转膜仪、湿转转膜仪购自美国BIO-RAD公司。
1.4 方法
1.4.1 细胞胶原收缩实验
实验分为对照组、凝血酶组。将PLA-801D-pSilence、PLA-801D- pSilence-shPAR1细胞用无血清培养基培养12h过夜，处理后调整细胞浓度为1×106个/ml，每组均做2个复孔。对照组，250μl细胞悬液加500μl鼠尾胶原；凝血酶组，250μl细胞悬液中加入终浓度为0.5U/ml的凝血酶，与500μl鼠尾胶原混匀，再置于3ml无血清培养基中，室外放置0.5h，使其胶原多聚化，然后再放置CO2细胞培养箱中孵育2周并观察，测量胶原直径。
1.4.2 蛋白免疫印迹（Western blot）
实验分为2组：对照组、凝血酶组。将PLA-801D- pSilence、PLA-801D-pSilence-shPAR1和PLA-801C-pIRES-EGFP、PLA-801C- pIRES-EGFP- PAR1细胞均饥饿12h，然后对照组继续饥饿24h，凝血酶组用0.5U/ml凝血酶处理24h。通过蛋白免疫印迹法（中国药典查询步骤）检测。
2.实验结果
2.1 凝血酶通过PAR1促进PLA-801D人巨细胞性肺癌细胞胶原的收缩
如图1结果所示，由A、C图可知当加入凝血酶后，PLA-801D人巨细胞性肺癌细胞对鼠尾胶原的收缩作用明显增强（p<0.01）；由B、D图可知，当PAR1干涉后，加入凝血酶后，PLA-801D人巨细胞性肺癌细胞对鼠尾胶原的收缩作用有所减弱（p﹥0.05）。
2.2 凝血酶对PAR1过表达和干涉的人巨细胞性肺癌细胞内p53表达的影响
如图2（A、B）结果所示，0.5U/ml凝血酶刺激PLA-801D和PLA-801C人巨细胞性肺癌细胞后，p53蛋白表达量下调，且与PAR1蛋白表达量成反相关。
4.讨论
从图1中，我们研究发现，当用加入1U/ml凝血酶时，PLA-801D-Psilence细胞有促进胞外基质胶原收缩的作用，而在PAR1被干涉后，PLA-801D-Psilence-shPAR1细胞对胞外基质胶原收缩的作用明显不如PLA-801D-Psilence细胞，这就说明了凝血酶可以通过PAR1来促进人巨细胞性肺癌细胞对细胞外基质的重塑，从而促进肿瘤的侵袭、转移和粘附。
为了探讨其机制，我们又检测了PLA-801D-pSilence、PLA-801D-pSilence-shPAR1和PLA-801C-pIRES-EGFP、PLA-801C-pIRES-EGFP-PAR1细胞株中的p53蛋白表达情况。0.5U/ml凝血酶刺激PLA-801D和PLA-801C人巨细胞性肺癌细胞后，p53蛋白表达量下调，且与PAR1蛋白表达量成反相关（图2A、B）。
5.结论与展望
凝血酶可以通过PAR1促进人巨细胞性肺癌细胞对胞外基质的重塑作用，这说明PAR1在人巨细胞性肺癌细胞的重塑功能中发挥着重要作用。同时，研究还发现PAR1与p53的蛋白表达量成反相关，且凝血酶还可以通过PAR1下调p53，但凝血酶是否唯一通过PAR1来调节p53影响人巨细胞性肺癌细胞的发生发展，尚不确定，仍需要進一步证明。
参考文献
[1] 李轩，谢立群.PARs与消化系肿瘤关系的研究进展[J].世界华人消化杂志2009年7月，17（21）：2179-2183.
[2] Peters AM，Kohfink B，Martin H，et al.Defective apoptosis due to a point mutation in the death domain of CD95 associated withautoimmune lymphoproliferative syndrome，T-cell lymphomaa and Hodgkin’ s disease[J].SO Exp Hematol，1999，27 （ 5）：8682874.
作者简介
何子阳（1986-）男，硕士，讲师，大庆广播电视大学。研究方向：远程教学，生物医学工程，163311。
迟玥（1986-），女，硕士，中级，研究方向：临床医学检验。大庆油田总医院，163311。