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限制酶是基因工程的工具酶之一，在基因工程的四大操作步骤中，第一步与第二步都要用到限制酶。正是因为发现限制酶，才诞生了基因工程技术。可以说，没有限制酶就没有基因工程。在高中生物课程有关基因工程内容的题目中，限制酶知识的考察运用也很普遍，因此，掌握好限制酶的知识对于基因工程技术的理解及解题运用都至关重要。
一、限制酶的来源及功能
限制酶是DNA限制性内切酶的简称。限制酶只能将外源的DNA切断，就是能限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。限制酶主要存在于原核生物中，目前已发现有200多种，每一种限制酶只能识别DNA上特定的碱基序列，并在特定位点切断DNA。因此，对于拥有限制酶的某些低等生物而言，这是在进化过程中形成的一种保护性功能；而对于基因工程技术而言，它为从某种物生物DNA上提取目的基因创造了条件。
例1 关于限制酶的途述，正确的是（ ）
A．限制酶是一种保护自我遗传信息的酶，每一种生物的细胞中都含有，但具有不同的特异性。
B．限制酶是基因的“剪刀”，能识别DNA上目的基因的序列，并切取该目的基因。
C．限制酶能特异性识别单链DNA上的序列，并在特定位点“剪断”单链。
D．要想从某生物的DNA上获取目的基因，使用的限制酶必须在该DNA上具有至少两个能识别的序列及相应切点。
解析 高等生物细胞中不存在限制酶；在基因工程中，限制酶所要识别的是基因两边的序列并有切点，而不是“基因的序列”；限制酶只能识别双链DNA上的序列，该序列具有“回文”性质，不能识别单链DNA上的序列；要想把基因“取下来”，必须在基因两边各有一个切点。
答案 D
二、限制酶与其它DNA相关酶的区别
DNA水解酶的功能是破坏DNA上的每一个磷酶二脂键，其结果是使DNA水解成单个脱氧核苷酸；限制酶则只破坏DNA上特定序列特定位点的磷酸二脂键，其结果是使DNA被分割成不同的DNA片段。DNA聚合酶的功能主要是在DNA片段与单个脱氧核某酸之间或单个脱氧核苷酸与单个脱氧核苷酸之间成磷酸二脂键，在DNA分子的复制中起使用，在此过程中需要模板；DNA连接酶则是在DNA片段之间将双链上的两个缺口同时连接起来，在基因工程操作的目的基因与运载体结合过程中起作用，此过程不需要模板。由此可见，以上四种酶所发挥作用的条件或结果各不相同。相同的是，这四种酶的作用对象均为DNA分子结构上的磷酸二脂键。
例2 下图是DNA结构模式图，据图所作的下列判断，不正确的是（ ）
[①][②]
A．限制性内切酶能将①处切断；
B．DNA连接酶能将①处连接；
C．解旋酶能切断②处；
D．连接②处的酶为DNA聚合酶。
解析 ①处为磷酸二脂键，限制酶能破坏磷酸二脂键，DNA连接酶能连接生成磷酸二脂键；②处为氢键，解旋酶可破坏DNA双链间的氢键，连接酶作用对象不是氢键。
答案 D
三、限制酶对DNA的切割及黏性末端的产生
要用限制酶把目的基因从某DNA上切下来，目的基因序列的两边必须各有一个能被限制酶识别的序列及其切点，因DNA是双链，故需“切断”4个磷酸二脂键，由此会产生四个黏性末端。为把目的基因连接到运载体的DNA上，一般需要用同一种限制酶对运载体DNA进行切割（至少有一个识别序列及切点），因为只有这样才能与切下的目的基因两边形成相同的黏性末端，目的基因和运载体才能实现连接而重组。但也有两种不同的限制酶切割产生相同的黏性末端，如G↓ATTCG和↓ATTC
例3 下面是5种限制性内切酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图（↓表示剪切点、切出的断面为黏性末端）：
限制酶1：——↓GATC——
限制酶2：——CATG↓——
限制酶3：——G↓GATCC——
限制酶4：——CCGC↓GG——
限制酶5：——↓CCAGG——
请指出下列哪组表达正确（ ）
A．限制酶2和4识别的序列都包含4个碱基对
B．限制酶3和5识别的序列都包含5个碱基对
C．限制酶1和3剪出的黏性末端相同
D．限制酶1和2剪出的黏性末端相同
解析 限制酶2、3、4、5识别的序列分别包括4个、6个、6个、5个碱基对，故A、B错。限制酶1和2切割产生的黏性末端不同。限制酶1剪出的黏性末端是：
[C T A G][G A T C][G A T C][C T A G]
限制酶3切割产生的黏性末端是：
[C C T A G G][G G A T C C] [G A T C C][G] [G][C Ｃ T A G]
答案 C
【练习】
1．如图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是（ ）
[C T T A A G] [G A A T T C][C T T A A G][G G A T T C] [①][②][③]
A．DNA连接酶、限制性内切酶、解旋酶
B．限制性内切酶、解旋酶、DNA连接酶
C．解旋酶、限制性内切酶、DNA连接酶
D．限制性内切酶、DNA连接酶、解旋酶
2．现有一长度为3000碱基对（bp）的线性DNA分子，用限制性内切酶酶切后，进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如图1；用酶B单独酶切，结果如图2；用酶H和酶B同时酶切，结果如图3。则该DNA分子的结构及其酶切图谱是（ ）
3．人体细胞内含有抑制癌症发生的P53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。
[G A A C C G G A G G][C T T G G C C T C C][G A A C T G G A G G][C T T G A C C T C C][正常人][患者][290对碱基][70对碱基][220对碱基][限制酶E
识别序列][限制酶E
识别序列][p53基因
部分区域]
①已知限制酶E识别序列为CCGG，若用限制酶E分别完成切割正常人和患者P53基因部分区域（见上图），那么正常人的会被切成 个片段；而患者的则被切割成长度为 对碱基和 对碱基的两种片段。
②如果某人的P53基因部分区域经限制酶E完全切割后，共出现170、220、290和460碱基对的四种片断，那么该人的基因型是 （以P+表示正常基因，P-表示异常基因）。
【参考答案】
1．C 2．A
3．①3、460、220 ②P+P-
（提示 ①患者发生了一个碱基对的替换，只有一个限制酶E的识别位点；②出现170、220、290个碱基对片段，说明该人的基因组成中含P+，而出现460个碱基对片段，则说明该人的的基因中也含P-）
一、限制酶的来源及功能
限制酶是DNA限制性内切酶的简称。限制酶只能将外源的DNA切断，就是能限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。限制酶主要存在于原核生物中，目前已发现有200多种，每一种限制酶只能识别DNA上特定的碱基序列，并在特定位点切断DNA。因此，对于拥有限制酶的某些低等生物而言，这是在进化过程中形成的一种保护性功能；而对于基因工程技术而言，它为从某种物生物DNA上提取目的基因创造了条件。
例1 关于限制酶的途述，正确的是（ ）
A．限制酶是一种保护自我遗传信息的酶，每一种生物的细胞中都含有，但具有不同的特异性。
B．限制酶是基因的“剪刀”，能识别DNA上目的基因的序列，并切取该目的基因。
C．限制酶能特异性识别单链DNA上的序列，并在特定位点“剪断”单链。
D．要想从某生物的DNA上获取目的基因，使用的限制酶必须在该DNA上具有至少两个能识别的序列及相应切点。
解析 高等生物细胞中不存在限制酶；在基因工程中，限制酶所要识别的是基因两边的序列并有切点，而不是“基因的序列”；限制酶只能识别双链DNA上的序列，该序列具有“回文”性质，不能识别单链DNA上的序列；要想把基因“取下来”，必须在基因两边各有一个切点。
答案 D
二、限制酶与其它DNA相关酶的区别
DNA水解酶的功能是破坏DNA上的每一个磷酶二脂键，其结果是使DNA水解成单个脱氧核苷酸；限制酶则只破坏DNA上特定序列特定位点的磷酸二脂键，其结果是使DNA被分割成不同的DNA片段。DNA聚合酶的功能主要是在DNA片段与单个脱氧核某酸之间或单个脱氧核苷酸与单个脱氧核苷酸之间成磷酸二脂键，在DNA分子的复制中起使用，在此过程中需要模板；DNA连接酶则是在DNA片段之间将双链上的两个缺口同时连接起来，在基因工程操作的目的基因与运载体结合过程中起作用，此过程不需要模板。由此可见，以上四种酶所发挥作用的条件或结果各不相同。相同的是，这四种酶的作用对象均为DNA分子结构上的磷酸二脂键。
例2 下图是DNA结构模式图，据图所作的下列判断，不正确的是（ ）
[①][②]
A．限制性内切酶能将①处切断；
B．DNA连接酶能将①处连接；
C．解旋酶能切断②处；
D．连接②处的酶为DNA聚合酶。
解析 ①处为磷酸二脂键，限制酶能破坏磷酸二脂键，DNA连接酶能连接生成磷酸二脂键；②处为氢键，解旋酶可破坏DNA双链间的氢键，连接酶作用对象不是氢键。
答案 D
三、限制酶对DNA的切割及黏性末端的产生
要用限制酶把目的基因从某DNA上切下来，目的基因序列的两边必须各有一个能被限制酶识别的序列及其切点，因DNA是双链，故需“切断”4个磷酸二脂键，由此会产生四个黏性末端。为把目的基因连接到运载体的DNA上，一般需要用同一种限制酶对运载体DNA进行切割（至少有一个识别序列及切点），因为只有这样才能与切下的目的基因两边形成相同的黏性末端，目的基因和运载体才能实现连接而重组。但也有两种不同的限制酶切割产生相同的黏性末端，如G↓ATTCG和↓ATTC
例3 下面是5种限制性内切酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图（↓表示剪切点、切出的断面为黏性末端）：
限制酶1：——↓GATC——
限制酶2：——CATG↓——
限制酶3：——G↓GATCC——
限制酶4：——CCGC↓GG——
限制酶5：——↓CCAGG——
请指出下列哪组表达正确（ ）
A．限制酶2和4识别的序列都包含4个碱基对
B．限制酶3和5识别的序列都包含5个碱基对
C．限制酶1和3剪出的黏性末端相同
D．限制酶1和2剪出的黏性末端相同
解析 限制酶2、3、4、5识别的序列分别包括4个、6个、6个、5个碱基对，故A、B错。限制酶1和2切割产生的黏性末端不同。限制酶1剪出的黏性末端是：
[C T A G][G A T C][G A T C][C T A G]
限制酶3切割产生的黏性末端是：
[C C T A G G][G G A T C C] [G A T C C][G] [G][C Ｃ T A G]
答案 C
【练习】
1．如图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是（ ）
[C T T A A G] [G A A T T C][C T T A A G][G G A T T C] [①][②][③]
A．DNA连接酶、限制性内切酶、解旋酶
B．限制性内切酶、解旋酶、DNA连接酶
C．解旋酶、限制性内切酶、DNA连接酶
D．限制性内切酶、DNA连接酶、解旋酶
2．现有一长度为3000碱基对（bp）的线性DNA分子，用限制性内切酶酶切后，进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如图1；用酶B单独酶切，结果如图2；用酶H和酶B同时酶切，结果如图3。则该DNA分子的结构及其酶切图谱是（ ）
3．人体细胞内含有抑制癌症发生的P53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。
[G A A C C G G A G G][C T T G G C C T C C][G A A C T G G A G G][C T T G A C C T C C][正常人][患者][290对碱基][70对碱基][220对碱基][限制酶E
识别序列][限制酶E
识别序列][p53基因
部分区域]
①已知限制酶E识别序列为CCGG，若用限制酶E分别完成切割正常人和患者P53基因部分区域（见上图），那么正常人的会被切成 个片段；而患者的则被切割成长度为 对碱基和 对碱基的两种片段。
②如果某人的P53基因部分区域经限制酶E完全切割后，共出现170、220、290和460碱基对的四种片断，那么该人的基因型是 （以P+表示正常基因，P-表示异常基因）。
【参考答案】
1．C 2．A
3．①3、460、220 ②P+P-
（提示 ①患者发生了一个碱基对的替换，只有一个限制酶E的识别位点；②出现170、220、290个碱基对片段，说明该人的基因组成中含P+，而出现460个碱基对片段，则说明该人的的基因中也含P-）