2019冠状病毒病（Coronavirus disease 2019,COVID-19）大流行是严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 型（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）快速传播的结果,SARS-CoV-2具有高传染性和高突变性,病毒感染人体后会出现严重程度不等的症状,甚至导致死亡。截至2021年6月2日,全球共计感染超过1.70亿例,已造成超过354万人死于COVID-19相关疾病。因此,SARS-CoV-2疫苗及其中和抗体的研究对于攻克COVID-19疾病至关重要。与其他冠状病毒类似,SARS-CoV-2病毒表面的包膜糖蛋白S三聚体蛋白能够和受体结合介导病毒与宿主细胞进行膜融合,是免疫系统的主要靶点,也是新冠疫苗研究及中和抗体研究的主要靶标。本研究首先基于SARS-CoV-2 S全长基因序列设计了四种SARS-CoV-2 S相关蛋白:预融合三聚体形式的S-2P蛋白,是对986和987两个氨基酸位点的脯氨酸突变和弗林蛋白裂解位点“AGAG”替换（残基682-685）,并在C末端截短19个氨基酸;NTD片段、RBD片段以及S2亚基。基于一株SARS-CoV S全长基因序列合成了 SARS-CoVS-2P基因用于真核细胞的表达、单抗的筛选和性质鉴定。另外,在SARS-CoV-2 S-2P基因序列的基础上,引入F817P、A892P、A899P和A942P四个氨基酸位点的突变,从而设计构建了 6个脯氨酸突变的S-6P蛋白。利用哺乳动物HEK 293F细胞进行表达,纯化后经SDS-PAGE、Western Blot、负染电镜观察和HPLC验证了蛋白的表达、三聚体形态、蛋白纯度和活性,并利用恢复期病人血清和鼠抗、兔抗对抗原性质进行鉴定,表明了这几种重组蛋白具有完整的表位,可以用于后续的小鼠免疫实验和抗体筛选。其次,以SARS-CoV-2 S-2P三聚体蛋白作为免疫原,通过间接ELISA方法和SARS-CoV-2假病毒中和系统检测验证了不同佐剂与不同免疫策略对诱导产生针对蛋白结合和病毒中和的抗体呈现差异,其中,新型复合佐剂FH-002C和Mn-004两种佐剂对于293F-S-2P蛋白可以较好地激起机体产生免疫应答,且50μg/只免疫剂量免疫293F-S-2P比5 μg/只效果更好,293F-S-2P刺激产生抗体的效果优于Bac-S-2P蛋白的效果,验证了真核细胞在表达蛋白加工修饰上的优势。对免疫小鼠细胞免疫应答的特征进行分析,所有免疫组都刺激产生了 IgG1、IgG2a和IgG2b应答,其中主要以IgG1应答为主,并且从IgG1/IgG2a 比值看出免疫应答偏向于Th2类,证明了蛋白免疫诱导产生了 B细胞介导的体液免疫应答。接着,通过多轮抗体筛选工作筛选得到了 34株单克隆抗体,对这些抗体的抗体亚类、抗体纯度、抗原结合能力、假病毒中和活性等性质进行了分析和鉴定,其中16株针对RBD表位的单抗,5株靶向S2蛋白的单抗,10株针对NTD表位的单抗以及有3株只结合SARS-CoV-2 S-2P蛋白,得到的单抗均与SARS-CoV-2 S-2P三聚体具有较好的结合活性,SARS-CoV-2假病毒中和检测结果显示靶向RBD的抗体具有较高滴度的中和能力,验证了 RBD表位为S三聚体上的优势中和表位,能够刺激机体产生较强的中和抗体。并利用ELISA阻断实验验证了 RBD抗体相互间的阻断情况以及与hACE2受体的阻断情况,通过进一步解析单克隆抗体的结构,得出分辨率分别为7.44 （?）,5.94 （?）,6.79 （?）和7.54A的1C4、8H12、9G11和13H7的表位特征,其中的1C4结合3个close状态的RBD,9G11和8H12分别结合3个open状态的RBD,且1C4不阻断hACE2受体与RBD的相互作用,但8H12和9G11部分在不同程度上阻断了受体的结合,13H7与已报道的4A8（靶向NTD抗体）相似,结合NTD表位,这些为研究抗体的中和机制提供了一定的信息。综上,本研究通过验证了哺乳动物HEK293F细胞表达的S-2P三聚体蛋白纯度高、三聚体形态明显且免疫原性良好,利用杂交瘤技术筛选得到了 34株单克隆抗体,鉴定了单克隆抗体结合蛋白和中和假病毒的能力,并解析了4个中和抗体的表位信息,为研制针对SARS-CoV-2的中和抗体及其抗体药物奠定基础并提供一定的指导意义。