白内障是一种晶状体组织退行性疾病,是致盲的主要病因。据统计,世界每年约有1500万白内障患者,我国白内障患者约400-500万,其中先天白内障的患病率约0.03%。虽然白内障疾病通过人工晶状体置换手术治疗后可恢复视力,但是对其疾病发生机制还不是十分清楚。研究表明热休克转录因子4（heat shock transcripition factor 4,HSF4）是调控晶状体发育的关键基因。HSF4基因突变与先天家族显性遗传性白内障发生密切相关。动物实验研究结果表明,敲除HSF4基因可导致小鼠,斑马鱼发生先天性白内障。HSF4在晶状体组织内具有双重调控作用。据报道,HSF4上调小分子热休克蛋白和晶状体蛋白（如HSP25,a B-crystallin,r-crystallin）的表达,同时还抑制FGF、HSP70和vimentin等基因转录表达。但是调控HSF4双重转录活性的机制还不清楚。深入研究调控HSF4转录活性的分子机制,对了解HSF4功能障碍导致白内障发病的机制以及晶状体发育调控机制具有重要意义。翻译后修饰对转录因子的转录活性具有重要的调控作用。HSF4受到多种翻译后修饰调控,影响其转录活性。我们实验室前期研究结果表明MEK6通过磷酸化修饰HSF4/T472位点,调控HSF4由细胞质向细胞核内转移,进而上调HSF4的转录活性。EGF-EGFR-MEK1-ERK1/2信号通路可以介导HSF4在S299位点的磷酸化,抑制其转录活性,另有报道BCAS2通过泛素化修饰HSF4的K206位点,促进其蛋白降解过程,从而抑制其转录活性。Biotin又称维生素H、辅酶R,也属于维生素B族。Biotin在物质代谢过程中扮演重要角色,是体内多种羧化酶的辅酶,能够在全羧化酶合成酶（Holocarboxylase synthetase,HLCS）的催化下与羧化酶蛋白中赖氨酸残基发生了共价结合,形成生物胞素,激活羧化酶的活性,参与细胞中糖异生、脂肪酸代谢以及蛋白质代谢。此外,有研究报道生物素通过翻译后修饰转录调控因子,参与调控基因表达。如Biotin修饰组蛋白H1,影响组蛋白与DNA双链的亲和力,能够改变染色质的构象,也能够影响转录因子与结构基因启动子的结合,参与基因的表达调控。Biotin也可以发挥一氧化氮（NO）样功能,通过s GC-PKG信号转导途经直接参与基因转录调控过程。此外,Biotin也可以直接修饰蛋白质,调控蛋白质的稳定性和功能,主要为一些分子伴侣和蛋白质合成相关的蛋白质,如HSP72,HSP60,烯醇化酶1（ENO1）等,但是Biotin是否调控HSF4的转录活性还未见报道。本课题以HEK293T细胞,晶状体上皮细胞HLE-B3,小鼠HSF4-/-晶状体上皮细胞系以及小鼠HSF4+/+晶状体上皮细胞（m LEC/Hsf4-/-和m LEC/HA-HSF4）等为实验材料,应用免疫沉淀和streptavidin pulldown的方法以及免疫印迹测定HSF4蛋白的Biotin修饰;应用定量PCR和免疫印迹方法测定HSF4下游基因表达;应用赖氨酸定点突变方法测定Biotin在HSF4蛋白中修饰氨基酸。实验结果表明在培养基中加入Biotin可抑制HSF4对下游HSP25和CRYAB的m RNA和蛋白的表达调控,抑制作用呈时间与剂量依赖关系。HSF4可以被Biotin修饰。在培养的晶状体上皮细胞中加入Biotin可上调Biotin对HSF4的修饰,过表达细菌Bir A（Biotin连接酶）可进一步增加Biotin对HSF4的修饰。定点突变结果显示,突变HSF4/K444R可降低HSF4与streptavidin的结合。综上所述,我们首次发现Biotin参与HSF4蛋白翻译后修饰。HSF4蛋白氨基酸序列中K444氨基酸是Biotin的潜在修饰位点。Biotin修饰可抑制HSF4的转录调控作用。因此,我们推测Biotin通过调控HSF4的转录活性参与调控晶状体的早期发育。