【摘 要】
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蛋白质的胞内靶点对于生物学功能研究以及疾病治疗都具有重要意义,但因缺乏高效的胞内递送载体,限制了以上应用的实现。蛋白质胞内递送存在几个重要环节:载体与蛋白质的有效结合、高效的细胞摄取和内涵体逃逸、蛋白质的及时释放。理想的蛋白质递送载体需要同时满足上述要求,才能提高胞内递送效率。为实现该目标,传统载体设计思路往往较为复杂,需对载体进行多种功能单元的修饰,以赋予载体多功能的特点。在本论文中,我们提出了
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蛋白质的胞内靶点对于生物学功能研究以及疾病治疗都具有重要意义,但因缺乏高效的胞内递送载体,限制了以上应用的实现。蛋白质胞内递送存在几个重要环节:载体与蛋白质的有效结合、高效的细胞摄取和内涵体逃逸、蛋白质的及时释放。理想的蛋白质递送载体需要同时满足上述要求,才能提高胞内递送效率。为实现该目标,传统载体设计思路往往较为复杂,需对载体进行多种功能单元的修饰,以赋予载体多功能的特点。在本论文中,我们提出了以聚酰胺-胺树枝状大分子（polyamidoamine,PAMAM）为骨架,通过单一结构单元修饰实现蛋白质递送载体多功能化的设计思路。论文第一部分在PAMAM表面修饰不同烷基链长度的叔胺分子得到高分子材料库,系统比较分析了叔胺分子结构对蛋白质结合、内涵体逃逸及胞内递送的影响规律。在此基础上,论文第二部分选择兼具结构与活性功能的瑞喹莫德（resiquimod,R848）免疫佐剂分子修饰PAMAM,深入研究了其作为载体递送蛋白质抗原及肿瘤细胞裂解物用于肿瘤免疫治疗的功能,为实现蛋白质胞内靶点的干预提供了新思路。论文具体研究内容如下:（1）构建了基于五代聚酰胺-胺树枝状大分子G5-PAMAM的pH敏感蛋白质胞内递送体系。通过在PAMAM表面修饰不同烷基链长度的叔胺分子得到高分子材料库。进一步以牛血清白蛋白和β-半乳糖苷酶作为模型蛋白,系统研究了高分子材料库中不同叔胺分子结构对复合物颗粒稳定性、细胞摄取、内涵体逃逸、溶血活性、蛋白质释放等构效关系的影响规律。筛选获得一种经过N,N-二丁基胺乙基修饰的PAMAM衍生物（G5-C4）,表现出更高的蛋白质胞内递送效率。研究结果表明,这与G5-C4中N,N-二丁基胺乙基的pH响应能力密切相关。在中性pH条件下,G5-C4载体能够通过叔胺的疏水作用增强与蛋白质的结合力,获得稳定的复合物纳米颗粒,而在内涵体酸性环境的刺激下,G5-C4的叔胺结构发生从疏水性向亲水性,以及中性向正电性的转变,在促进蛋白质释放的同时增强高分子与内涵体膜的作用力,促进内涵体逃逸,有效克服蛋白质胞内递送障碍。在体内肿瘤治疗实验中,通过G5-C4递送核糖核酸酶A细胞毒性蛋白质,能够有效抑制肿瘤生长。（2）在深入理解蛋白质胞内递送规律的基础上,针对肿瘤疫苗需要将蛋白质抗原及免疫佐剂共递送至抗原提呈细胞（antigen-presenting cells,APCs）内的需求,发展了佐剂辅助的蛋白质抗原胞内递送载体系统并用于抗肿瘤免疫治疗。通过在G5-PAMAM表面修饰R848衍生物,获得了化学结构与生物活性有机统一的G5-R848递送载体。其中,在结构方面,R848能够通过疏水、π-π堆积等作用增强载体与蛋白质抗原的结合能力,形成稳定的纳米复合物。R848结构中苯环的膜融合特性能够促进G5-R848抗原复合物的内涵体逃逸。R848衍生物中的二硫键可以通过胞质还原响应性能促进蛋白质抗原的释放。在生物活性方面,R848是toll样受体（toll-like receptor,TLR）7/8的激动剂,可作为免疫佐剂增强抗原的免疫活性。体外和体内实验证明,所制备的G5-R848纳米疫苗能够将蛋白质抗原和免疫佐剂时空协同递送至同一APCs,实现高效的抗原交叉提呈,并进一步刺激细胞免疫,引起抗原特异性T细胞的激活和增殖。G5-R848与肿瘤抗原形成的精简化纳米疫苗对于肿瘤预防和肿瘤治疗都有很好的效果。在肿瘤手术切除及复发实验中,G5-R848能与切除的肿瘤组织来源的细胞裂解物形成个性化肿瘤纳米疫苗,该疫苗自身或联用免疫检查点抑制疗法,能够有效抑制术后肿瘤复发和转移,显著延长小鼠生存期。
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