【摘 要】
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金枪鱼内脏富含多种脂质,并且含有丰富的二十碳五烯酸（eicosapentenoic acid,EPA）和二十二碳六烯酸（docasahexenoic acid,DHA）,是近年来海洋生物加工废弃物综合利用的重要资源。本论文以金枪鱼内脏为原料,采用酯交换法制备EPA和DHA（记为EPA＆DHA）结构脂质,并对催化条件进行优化。基于质谱的脂质组学技术可以实现对脂质的全面分析,因此本课题采用液相色谱与质
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金枪鱼内脏富含多种脂质,并且含有丰富的二十碳五烯酸（eicosapentenoic acid,EPA）和二十二碳六烯酸（docasahexenoic acid,DHA）,是近年来海洋生物加工废弃物综合利用的重要资源。本论文以金枪鱼内脏为原料,采用酯交换法制备EPA和DHA（记为EPA＆DHA）结构脂质,并对催化条件进行优化。基于质谱的脂质组学技术可以实现对脂质的全面分析,因此本课题采用液相色谱与质谱联用的技术对结构脂质进行表征,从分子水平对酯交换过程动态分析,并结合多元统计分析寻找差异代谢物。本课题主要研究内容如下:1、采用超声辅助有机溶剂浸提的方法提取鱼油。对比有机溶剂氯仿-甲醇（v/v,2:1）、95%乙醇、无水乙醇、异丙醇、正己烷、环己烷、乙酸乙酯七种有机溶剂的粗脂提取率,磷脂提取率,理化指标（酸值、不皂化物、碘值、粗蛋白）以及脂肪酸组成,最终选取无水乙醇作为提取溶剂。采用丙酮沉降法分离磷脂与甘油酯,作为后续酯交换的原料。2、通过尿素包合法富集乙酯型EPA＆DHA（EPA＆DHA-EE）,单因素实验优化得出最优尿素包合条件为乙醇与脂肪酸乙酯比例3:1、尿酯比1.5:1、结晶温度-5℃、结晶时间10 h,最佳条件下获得EPA＆DHA-EE得率89.47%,回收率76.33%。随后,在无溶剂体系下,对酶催化金枪鱼甘油酯与EPA＆DHA-EE的酯交换反应体系进行了研究。在确定温度60℃、催化时间20 h的条件下,对催化剂Novozym 435（N435）、Lipozyme RM IM（LRI）、Lipozyme TL IM（LTI）从含水量、底物比、酶的添加量三个因素分别进行优化。N435的最优催化条件为:含水量0.5%、底物质量比1:2、酶添加量20%,此时催化产物中甘油三酯型EPA＆DHA链（EPA＆DHA-TAG）相对含量达68.74%。LRI的最佳催化条件为:含水量1.5%,底物质量比1:4、酶添加量20%,此时产物中EPA＆DHA-TAG相对含量达73.26%。LTI的最佳催化条件为:含水量2%、底物质量比1:4、酶添加量25%,此时产物中EPA＆DHA-TAG相对含量达56.13%。高效液相串联轨道阱质谱（HPLC-Orbitrap-MS/MS）对酶催化酯交换产物甘油三酯定性定量,并对三种酶最优条件下的催化产物中EPA＆DHA-TAG分子样本和含量建立多元统计分析模型,得到潜在生物标志物TAG（16:0/22:6/22:6）、TAG（20:5/22:5/22:6）、TAG（16:1/20:5/22:5）等。3、对EPA＆DHA-EE酸化制备EPA＆DHA游离脂肪酸（EPA＆DHA-F）,并以EPA＆DHA-F为酰基供体,在脂肪酶的催化下与金枪鱼内脏磷脂发生酸解反应,富集磷脂型EPA与DHA（EPA＆DHA-PL）。固定正己烷添加量为3 m L,催化温度60℃,反应时间24 h,分别对比脂肪酶Novozyme 435（N435）,Lipozyme RM IM（LRI）和Phospholipase A1（PLA1）在不同的含水量、底物质量比和酶的添加量条件下催化酯交换产物中EPA＆DHA-PL的含量。PLA1的最优催化条件为:含水量0.5%、底物质量比1:2、酶添加量20%,此时催化产物中EPA＆DHA-PL总含量达186.39 mg/g。LRI的最佳催化条件为:含水量1%,底物质量比1:4、酶添加量20%,此时产物中EPA＆DHA-PL总含量达168.10 mg/g。N435的最佳催化条件为:含水量0.25%、底物质量比1:5、酶添加量20%,此时产物中EPA＆DHA-PL总含量达114.13 mg/g。采用亲水作用色谱串联前体离子质谱（HILIC-Pre IS-MS）,锁定m/z 301.6和m/z 327.6分别对含有EPA＆DHA酰基链的PL进行定性定量,并对三种酶最优条件下的催化产物中EPA＆DHA-PL分子样本和含量建立多元统计分析模型,得到潜在生物标志物PC（p-16:0/22:6）,PC（18:0/20:5）,PC（16:0/20:5）等。
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