【摘 要】
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目的:探讨Sig-1R（Sigma-1 receptor）对胰岛β细胞增殖的调控作用,并在脂毒性条件下探讨Sig-1R对胰岛β细胞损伤的影响及其可能机制。方法:在小鼠胰岛β细胞系MIN6细胞中,利用慢病毒载体转染技术建立稳定敲减及过表达Sig-1R的细胞株。使用流式细胞仪检测Sig-1R对MIN6细胞增殖率及细胞周期的影响。采用基因转录组测序技术,筛选Sig-1R敲减MIN6细胞与空载对照组细胞之
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目的:探讨Sig-1R（Sigma-1 receptor）对胰岛β细胞增殖的调控作用,并在脂毒性条件下探讨Sig-1R对胰岛β细胞损伤的影响及其可能机制。方法:在小鼠胰岛β细胞系MIN6细胞中,利用慢病毒载体转染技术建立稳定敲减及过表达Sig-1R的细胞株。使用流式细胞仪检测Sig-1R对MIN6细胞增殖率及细胞周期的影响。采用基因转录组测序技术,筛选Sig-1R敲减MIN6细胞与空载对照组细胞之间的差异表达基因,并进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes）分析,分析差异表达基因在各基因功能条目及生物学通路中的富集情况。采用QT-PCR（Quantitative polymerase chain reaction in real-time,实时定量聚合酶链反应）方法验证这些差异表达基因中Sig-1R调控MIN6细胞周期的可能靶基因。利用四唑单钠盐（Cell Counting Kit-8,CCK8）法、流式细胞仪、酶联免疫吸附实验检测高脂条件下（0.5mmol/L棕榈酸培养）Sig-1R对胰岛β细胞活性、细胞凋亡率及胰岛素分泌的影响。并用蛋白免疫印迹检测高脂条件下Sig-1R对胰岛β细胞胰岛素分泌相关基因Pdx1（pancreatic and duodenal homeobox 1,胰岛素促进因子1）、内质网应激标志分子GRP78（glucose regulated protein 78,葡萄糖调节蛋白78）、CHOP（C/EBP homologous protein,C/EBP同源蛋白）以及线粒体相关凋亡蛋白Bcl-2（B-cell lymphoma-2,B细胞淋巴瘤-2）、Bax（Bcl2-Associated X蛋白质）和Cyt-c（cytochrome c,细胞色素c）的表达调控。采用免疫荧光检测高脂条件下Sig-1R对胰岛β细胞PDI（protein disulfide isomerase,蛋白质二硫键异构酶）表达的调控作用。使用酶标仪、流式细胞仪检测高脂条件下Sig-1R对胰岛β细胞中ATP（Adenosine Triphosphate,三磷酸腺苷）和ROS（reactive oxygen species,活性氧）以及线粒体膜电位的影响。采用透射电子显微镜技术检测Sig-1R对MIN6细胞线粒体相关内质网膜（mitochondria associated ER membranes,MAM）结构的影响。并用免疫荧光法检测Sig-1R对MAM关键蛋白IP3R（inositol 1,4,5-trisphosphate receptor,1,4,5-三磷酸肌醇受体）和VDAC1（voltage-dependent anionchannel,电压依赖性阴离子通道）共定位的影响。采用流式细胞仪和蛋白免疫印迹分别检测Sig-1R对胞浆钙离子水平以及钙蛋白酶Calpain-1蛋白的表达调控。结果:在MIN6细胞中Sig-1R敲减可抑制细胞增殖,使细胞周期G0/G1期细胞比率增加,S期细胞比率减少,抑制细胞周期进程;相反,Sig-1R过表达可促进细胞增殖,使细胞周期G0/G1期细胞比率减少,S期细胞比率增加,促进细胞周期进程。转录组测序GO和KEGG分析均显示Sig-1R敲减对细胞周期有抑制作用。QT-PCR验证发现Sig-1R敲减对细胞周期的调控通路可能为Fox M1/Plk1/Cenpa通路。在脂毒性条件下敲减Sig-1R可减少MIN6细胞存活率,加重细胞凋亡,同时减少胰岛素分泌以及Pdx1表达;相反,过表达Sig-1R可增加细胞存活率,减轻细胞凋亡,并增加胰岛素分泌以及Pdx1表达。且敲减Sig-1R使脂毒性条件下MIN6细胞PDI、内质网应激标志分子（GRP78、CHOP）以及线粒体相关凋亡蛋白（Bax、Cyt-c）表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,ATP以及线粒体膜电位水平下降,ROS水平上升,过表达Sig-1R则起相反作用。此外,Sig-1R敲减使MIN6细胞线粒体和内质网接触点减少,Sig-1R过表达则使其增加。且在脂毒性条件下Sig-1R敲减使MIN6细胞MAM关键蛋白IP3R和VDAC1蛋白表达减少以及胞浆钙离子水平增加,Sig-1R过表达则使VDAC1蛋白表达增加以及胞浆钙离子水平下降。结论:过表达Sig-1R可促进胰岛β细胞增殖,而敲减Sig-1R则抑制β细胞增殖,可能与对细胞周期的调控作用相关。过表达Sig-1R可改善高脂条件下胰岛β细胞损伤,而敲减Sig-1R则加剧β细胞损伤,其机制可能为改变线粒体相关内质网膜结构而影响胞浆钙离子水平,从而进一步调控内质网应激和线粒体功能。
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